Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS РАЗЛИЧНЫХ ПОДВИДОВ И БИОВАРОВ МЕТОДАМИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И МУЛЬТИЛОКУСНОГО СИКВЕНС-ТИПИРОВАНИЯ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к дифференциации штаммов возбудителя чумы по подвидам и биоварам и к молекулярному типированию Yersinia pestis, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора.

Изобретение выполнено в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» и в соответствии с Государственным контрактом №70-Д от 25.07.2011 г.

Согласно существующей в настоящее время внутривидовой классификации возбудителя чумы штаммы - Y. pestis на основании ряда биохимических признаков делят на подвиды и биовары. Однако фенотипическая экспрессия дифференциальных биохимических признаков может значительно варьировать в зависимости от условий существования возбудителя. Генетические методы внутривидовой дифференциации возбудителя чумы обладают большими преимуществами по сравнению с методами фенотипической дифференциации, поскольку дают более стабильные и надежные результаты.

Штаммы Y. pestis, циркулирующие в природных очагах чумы на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, объединены в 5 подвидов: основной (античный, средневековый и восточный биовары) и 4 неосновных - кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский. Несмотря на то, что штаммы разных подвидов и биоваров близки по свойствам, они значительно отличаются по вирулентности и эпидемической значимости, и поэтому разработка эффективных и надежных методов их дифференциации имеет важное значение.

Используемые для дифференциации штаммов У. pestis способы основаны на секве-нировании генов жизнедеятельности и вирулентности возбудителя (Achtman et al. Yersinia pestis, the cause of plague is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96:14043-48; Kotetishvili et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(6):2674-84), которые отличаются значительным консерватизмом, ограничивающим их применение для проведения внутривидового генотипирования возбудителя чумы. Применение для этих целей более изменчивых участков генома - областей вариабельных тандемных повторов (VNTR) - также не позволяет проводить надежную дифференциацию штаммов Y. pestis на подвиды и биовары из-за их высокой вариабельности или расположения в нестабильных областях генома, которые могут утрачиваться в результате протяженных делеций (Брюханов с соавт., 2001; Klevitska et al. Identification and Characterization of Variable-Number Tandem Repeats in the Yersinia pestis Genome. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(9):3179-85; Сучков с соавт. Генотипирование Yersinia pestis: вариабельность локуса (сааа)_n у природных штаммов, выделенных на территории бывшего СССР. Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 2002; 4:18-21; Сучков с соавт. Мультиплексный VNTR-анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природном очаге. Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 2004; 4:19-28; патент RU №2332464, опубликовано 27.08.2008).

Известен способ дифференциации иерсиний методом мультилокусного сиквенс-типирования фрагментов генов жизнедеятельности glnA, gyrB, recA, Y-Н8Р60, полученных в полимеразной цепной реакции (Kotetishwili et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(6):2674-84). Другие гены жизнеобеспечения - dmsA, tmk, trpE, thrA и glnA, а также ген mаnВ, участвующий в синтезе липополисахарида, являются также высоко консервативными и практически идентичны у штаммов У. pestis (Achtman et al. Yersinia pestis, the cause of plague is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA. 1999; 96:14043-48). Однако использование этих генов позволяет дифференцировать возбудителя чумы от других представителей рода Yersinia, но не дает возможности определять принадлежность штамма к конкретному подвиду и биовару. В литературе отсутствуют и другие публикации об использовании метода мультилокусного сиквенс-типирования для проведения одновременной дифференциации возбудителя чумы на подвиды и биовары.

В настоящее время существует зарегистрированная тест-система, предназначенная для экспресс-диагностики чумы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и состоящая из набора праймеров, которые выявляют фрагменты генов cafl и pla, расположенные на плазмидах чумного микроба, отвечающие за синтез фракции I и пестицина («Ген Пест» ТУ8895-005-0189). Существенным ее недостатком является то, что она предназначена для детекции только типичных штаммов возбудителя чумы.

Известны способы дифференциации патогенных видов рода Yersinia (Т pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica), основанные на мультилокусной ПЦР (Стенкова A.M. с соавт. Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 2008; 3:18-23; Патент RU №2385941), или ПЦР в несколько этапов (патент DE 10124342). Однако эти способы не пригодны для выявления внутривидовых групп возбудителя чумы.

Предложенная В.Е.Куклевым с соавторами тест-система на основе генов irp2, lcrV и локуса "3а" позволяет определять видовую принадлежность штаммов Y. pestis с одновременной дифференциацией вирулентных штаммов от авирулентных, но не дает возможности проводить внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы (Куклев В.Е. с соавт. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y. pestis. Сб. VI всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней». Москва, 2007; 1:376-77).

Существует способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Y. pestis, основанный на поэтапном проведении нескольких ПЦР с использованием праймеров, специфичных для вида Y. pestis и группы неосновных подвидов этого возбудителя (Патент RU 2404251). Использование этого способа позволяет отнести испытуемый штамм к виду У. pestis и выявить его принадлежность только к кавказскому подвиду или биовару microtus. Недостатком данного способа является невозможность с его помощью определить принадлежность штамма к конкретному неосновному подвиду (алтайский, гиссарский, улегейский) и биовару (античный, средневековый, восточный).

Известен способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (патент RU №2332464), основанный на ПЦР с использованием праймеров, комплементарных hutG-YP01967 области возбудителя чумы. В качестве ДНК мишеней в этом способе использованы VNTR-локусы, которые характеризуются значительной вариабельностью. Это требует применения набора референтных штаммов, что значительно затрудняет осуществление данного способа и осложняет анализ получаемых результатов. Этот способ также не предусматривает разделения штаммов основного подвида по их биоварной принадлежности.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов Y. pestis методом мульти-локусного сиквенс-типирования (патент RU №2415948), предусматривающий определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH, с последующей подвидовой дифференциацией путем сравнения их с последовательностями этих генов у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов. Данный способ не дает возможности определять принадлежность штаммов Y. pestis к конкретному биовару.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования с использованием набора праймеров AraC-s/AraC-as и RhaS-s/RhaS-as (патент RU №2404256), включающий проведение полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов генов rhaS и araC и определение их нуклеотидных последовательностей. Генотип исследуемого штамма устанавливают путем сравнения с генотипами основного и неосновных подвидов. Выбранные ДНК мишени позволяют проводить подвидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы, но не проводят разделение этих штаммов по их биоварной принадлежности. В связи с этим возникает необходимость дополнения двух используемых ДНК-мишеней другими генами, вариабельность которых позволяет установить принадлежность испытуемого штамма к конкретному биовару.

Описанные способы предназначены для дифференциации штаммов Y. pestis по их принадлежности к определенному подвиду - основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому, улегейскому. Однако ни один из вышеперечисленных способов не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов Y. pestis с одновременным определением их принадлежности к конкретному подвиду и биовару, что сужает их диагностические возможности. В связи с этим существует необходимость создания способа одновременной дифференциации штаммов возбудителя чумы по их подвидовой и биоварной принадлежности.

Задачей предлагаемого изобретения является создание специфичного, чувствительного и простого способа дифференциации штаммов возбудителя чумы, позволяющего одновременно определять принадлежность штамма Yersinia pestis к определенному подвиду и биовару.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении диагностических возможностей внутривидовой дифференциации возбудителя чумы за счет одновременного установления подвидовой и биоварной принадлежности штаммов Yersinia pestis.

Способ дифференциации штаммов Y. pestis различных подвидов и биоваров методами ПНР и мультилокусного сиквенс-типирования предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с праймерами Nap469/Nap1187, rhaSc-s/rhaSc-a, glpD-F1/glpD-R1, aRaCF2/aRaCR2 для амплификации фрагментов генов парА, rhaS, glpD, araC, определение их нуклеотидной последовательности, установление генотипа по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 613, 1021 гена nарА и по делеции 93 п.н. (в позиции 9-111) гена glpD, и выявление сиквенс-типа штамма Y. pestis по определенным аллелям используемых генов с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами различных биоваров основного и неосновных подвидов; при этом античный биовар основного подвида имеет сиквенс-тип 1ST - gpD1 np1 rhS1 arC1; средневековый биовар - 2ST-gpD1 np2 rhS1 arC1; восточный биовар - 3ST-gpD2 np1 rhS1 arC1; кавказский подвид - 4ST-gpD1 np3 rhS2 arC1; алтайский подвид - 5ST-gpD1 nр3 rhS3 arC2; гиссарский подвид - 6ST-gpD1 np3 rhS4 arC2; улегейский подвид - 7ST-gpD1 np3 rhS4 arC1. Сконструированные праймеры на гены парА, rhaS имеют следующие последовательности:

Для одновременного определения подвидовой и биоварной принадлежности штаммов Y. pestis впервые предложено использование генов, детерминирующих дифференциально-значимые признаки: rhaS (регулятор рамнозного оперона), аrаС (регуляторный ген арабинозного оперона), nарА (ген периплазматической нитратредуктазы), glpD (ген глицерол-фосфат-дегидрогеназы).

Олигонуклеотидные праймеры rhaSc-a/rhaSc-s и Nap469/Nap1187, используемые для амплификации диагностически значимых генов rhaS и nарА сконструированы авторами на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штаммов возбудителя чумы С092, KIM, Pestoides F, Angola и 91001, представленных в базе данных NCBI GenBank.

К моменту разработки заявляемого способа праймеры на гены аrаС, glpD описаны в литературе (патент RU №2404256; Motin et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS 100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD). J Bacteriol. 2002; 184(4):1019-27).

Подобранное сочетание праймеров Nap469/Napll87, rhaSc-s/rhaSc-a, gIpD-F1/glpD-R1, aRaCF2/aRaCR2 при реализации предлагаемого способа обеспечивает определение подвидовой и биоварной принадлежности штаммов Y. pestis.

Используемые олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, nарА, аrаС и glpD имеют следующие нуклеотидные последовательности:

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.2569-09). Амплификацию фрагментов генов glpD, napA, rhaS и аrаС проводят с применением праймеров glpD-F1-gIpD-R1, Nap469-Nap1187, rhaSc-s-rhaSc-a и aRaCF2-araCR2 по следующей программе: 1-й цикл - 95°С, 5 мин; затем 35 циклов - 95°С, 45 сек; 56°С, 45 сек; 72°С, 1 мин и завершающий цикл 72°С - 5 мин.

Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР - фрагментов генов glpD, nарА, rhaS и аrаС проводят на автоматическом секвенаторе по методу F. Sanger et al. (Sanger et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1977; 74(12): 5463-67) с использованием прямых и обратных праймеров.

Для установления генотипа исследуемого штамма проводят определение наличия делеции 93 п.н. (позиция 9-111) гена glpD и нуклеотидов, находящихся в позициях 613 гена napA, 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена аrаС.

Штаммы основного подвида античного биовара имеют Teaoivar.glpD: (9-111, napA: 613-G; rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; аrаС: 773-Т;

средневекового биовара имеют генотип: glpD: Δ9-111, napA: 613-Т; rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; аrаС: 773-Т;

восточного биовара имеют генотип: glpD: int; napA: 613-G; rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; аrаС: 773-Т;

кавказского подвида имеют генотип: glpD: Δ9-111, napA: 613-G, rhaS: 482-G, 494-С, 671-G, аrаС: 773-Т,

алтайского подвида имеют генотип: glpD: Δ9-111, napA: 613-G, rhaS: 482-G, 494-Т, 671-G; аrаС: 773-G;

гиссарского подвида имеют генотип: glpD: Δ-9111, napA: 613-G, rhaS: 482-A, 4-94-T, 671-G; аrаС: 773-G;

улегейского подвида имеют генотип: glpD: Δ9-111, napA: 613-G, rhaS: 482-A, 494-T, 671-G; аrаС: 773-Т.

Аллели генов glpD, napA, rha и аrаС у штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов определяют проведением сравнительного анализа нуклеотидов, находящихся в позициях 613 гена napA, 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена аrаС, наличие делеции 93 п.н. (9-111) в гене glpD.

Из 2 аллелей гена glpD,

первая gpD1 (Δ9-111) - у штаммов основного подвида античного и средневекового биоваров, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов;

вторая gpD2 (инт.) - у штаммов основного подвида восточного биовара.

Из 3 аллелей гена napA,

первая np1 (613-G) - у штаммов основного подвида античного и восточного биоваров;

вторая nр2 (613-Т) - у штаммов основного подвида средневекового биовара;

третья nр3 (613-G, 1021-А) - у штаммов кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов.

Из 4 аллелей гена rhaS,

первая rhS1 (482-G, 494-Т, 671-А) - у штаммов основного подвида,

вторая rhS2 (482-G, 494-C, 671-G) - у штаммов кавказского подвида,

третья rhS3 (482-G, 494-Т, 671-G) - у штаммов алтайского и улегейского подвидов,

четвертая rhS4 (482-А. 494-Т, 671-G) - у штаммов гиссарского подвида.

Из 2 аллелей гена аrаС,

первая arC1 (773-Т) - у штаммов основного подвида античного, средневекового и восточного биоваров, кавказского и улегейского подвидов,

вторая arC2 (773-G) - у штаммов алтайского и гиссарского подвидов.

Сиквенс-тип присваивают каждому подвиду с определенным сочетанием аллелей генов glpD, napA, rhaS и аrаС.

Штаммы основного подвида античного биовара имеют 1 ST-gpD1 np1 rhS1 arC1;

штаммы основного подвида средневекового биовара 2 ST-gpD1 nр2 rhS1 arC1;

штаммы основного подвида восточного биовара 3 ST-gpD2 np1 rhS1 arC1;

штаммы кавказского подвида 4 ST - gpD1 nр3 rhS2 arC1;

штаммы алтайского подвида 5 ST - gpD1 np3 rhS3 аrC2;

штаммы гиссарского подвида 6 SТ - gpD1 np3 rhS4 arC2;

штаммы улегейского подвида 7 ST - gpD1 nр3 rhS3 arC1.

Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов glpD, napA, rhaS и аrаС у штаммов различных подвидов Y. pestis представлены в таблице 1. Интерпретацию полученных результатов осуществляют в соответствии с таблицей 2.

Принципы дифференциации наглядно отражены на фигуре.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример. Дифференциация по биовару штамма Y. pestis (модельный эксперимент).

Выделение ДНК штамма Y. pestis проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. (МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности»).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10×ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 1-2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматриваются в УФ свете.

Нуклеотидные последовательности образованных в ПЦР фрагментов генов glpD, nарА, rhaS и аrаС, определяют на автоматическом секвенаторе по методу F. Sanger et al. (Sanger et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1977; 74(12); 5463 - 67) с использованием прямых и обратных праймеров. В определенных нуклеотидных последовательностях генов glpD, nарА, rhaS и аrаС, устанавливают наличие делеции 93 п.н. (9-111) и нуклеотиды, находящиеся в позициях 613 и 1021 гена nарА, 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена агаС и определяют генотип штамма. Штамм Y. pestis имеет генотип glpD: А 9-111, nарА: 613-G, 1021-G, rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; аrаС: 773-Т. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 1: gpD1 np1 rhS1 arC1, характерный для штаммов античного биовара основного подвида чумного микроба, из чего делают вывод о принадлежности штамма Y. pestis к основному подвиду античному биовару Y. pestis.

Аналогичным образом проводят дифференциацию штаммов других биоваров и подвидов.

Отличительной особенностью заявляемого способа является использование в качестве ДНК-мишеней - генов glpD, nарА, rhaS и аrаС, ранее не использовавшихся в таком сочетании для внутривидовой дифференциации Yersinia pestis. Преимущество применения этих генов заключается в том, что они позволяют дифференцировать не только основной и неосновные подвиды с точным отнесением изучаемого штамма к одному из пяти подвидов Yersinia pestis (кавказский, алтайский, гиссарский, улегейский), но и определять принадлежность изучаемых штаммов к конкретному биовару (античный, средневековый, восточный) возбудителя чумы. Использование заявляемого способа значительно повышает эффективность внутривидовой дифференциации возбудителя чумы, поскольку дает возможность проводить генетическую дифференциацию штаммов Yersinia pestis не только по подвидам, но и биоварам, что существенно расширяет диагностические возможности заявляемого способа. Заявленный способ успешно апробирован на 64 штаммах возбудителя чумы.

Таким образом, заявленный способ, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов дифференциально значимых генов rhaS, napA, аrаС и glpD, позволяет эффективно и надежно приводить дифференциацию возбудителя чумы по подвидам и биоварам, а также устанавливать происхождение и географическую приуроченность испытуемого штамма Yersinia pestis.