Способ получения магнитных сорбентов для концентрирования патогенов с последующей постановкой масс-спектрометрии

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и в частности, к способу получения магнитных сорбентов для концентрирования патогенов с последующей постановкой масс-спектрометрии (МС).

Для анализа белков и пептидов, определения бактериальных патогенов в низких концентрациях наиболее эффективным считается выявление возбудителей методом масс-спектрометрии с предварительным концентрированием. Метод масс-спектрометрии с мягкими методами ионизации в особенности MALDI MS обладает высокой чувствительностью и позволяет проводить успешный качественный анализ образца, содержащего пико- и аттомоли аналита [1]. Однако при использовании этого метода анализа могут возникнуть затруднения, связанные с высоким содержанием матричных и сопутствующих элементов, создающих помехи сигналам и снижающих чувствительность определения. Следовательно, для удаления матрицы, обусловливающей полиатомные спектральные наложения при МС определении, необходима стадия концентрирования. Для этого перспективны сорбционные системы, сочетающие сорбент-реагент-элюент, обеспечивающие количественное извлечение патогенов и их десорбцию. В этом случае не требуется проведение длительного и трудоемкого разложения концентратов, становится возможным многократное использование сорбента и on-line определение возбудителя в элюате.

Использование сорбентов с магнитными свойствами, характеризующихся эффективностью извлечения аналитов из сложных смесей позволяет провести предварительное концентрирование и очистку от посторонних примесей, что приводит к совершенствованию процесса пробоподготовки.

Описание применения магнитных сорбентов для концентрирования патогенов из объектов окружающей среды с последующей постановкой масс-спектрометрии в литературе единичны. Наиболее близким к заявляемому методу является применение магнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы [2]. Но данный сорбент, применяемый для иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), показал отрицательные результаты при постановке масс-спектрометрического анализа.

Известна технология получения композиционного сорбента на основе карбоната и гидроксида магния, включающая использование природного магнийсодержащего материала, в состав которого входят: карбонат магния (51,62-52,84%) и гидроксид магния (46,19-47,28%). Этот материал размалывают до размера частиц 3-10 мкм и используют в качестве сорбента для очистки сточных вод от ионов хрома (III), железа (III), меди (II) по механизму ионного обмена [3].

Недостаток технологии - низкая емкость сорбента, что обусловлено его малой удельной поверхностью доступной для ионного обмена при контакте сорбента с подлежащей очистке водой.

Известен способ получения сорбента на основе полимерного анионита с иммобилизованными оксидами железа [4]. На первой стадии в полимерный анионит вводятся анионы-окислители MnO₄, а затем ионит обрабатывают раствором соли двухвалентного железа, причем в результате реакции окисления Fe⁺² образуются нерастворимые смешанные оксиды и гидроксиды трехвалентного железа. Максимальное содержание железа в макропористом сорбенте после трех таких циклов насыщения-осаждения может достигать 16 масс. %. Данный способ применим для сорбции мышьяка и требует использования колонки для заполнения сорбентом. Описание применения в масс-спектрометрии отсутствует.

Данный способ получения композитного сорбента является технологически сложным, многостадийным, дорогостоящим, т.к. требует использования окислителей, колонок и длительной промывки сорбента от токсичных соединений марганца.

В связи с этим целью исследования стала разработка эффективного сорбента с магнитными свойствами для концентрирования патогенов, подбор элюирующих растворов и апробация в масс-спектрометрии.

Технический результат достигается тем, что способ включает окисление сульфата железа (II) - FeSO₄ в присутствии нагретого гидроксида калия (KOH). При этом формируется труднорастворимое соединение - гидроксид железа, обладающий сорбционными, магнитными и другими свойствами [5, 6].

Известно, что фазовый и дисперсный состав образующихся соединений железа зависит от многочисленных параметров синтеза: температуры и рН реакционной среды, концентрации реагентов, скорости подачи окислителя, его активности и т.д.

При синтезе использовали реагенты квалификации «хч»: 2,5 г FeSO₄, растворенного в 25 мл дистиллированной воды, в течение 1 мин добавляли к 50 мл доведенного до температуры кипения 5% раствора КОН. По окончании процесса окисления осадок отделяли от маточного раствора, отмывали водой до прозрачного надосадка.

К полученному в результате синтеза гидроксиду железа II вносили 30 мл 50% раствора полиглюкина. Перемешивали и проводили гелеобразование в течение 2 ч при температуре 22±4°С. Разливали в фарфоровые чашки и прокаливали при температуре 110-120°С в течение 20-30 мин. Измельчение частиц проводили на планетарной шаровой мельнице «Fritsch Р-7» в течение 1 мин, что позволило получить магнитные частицы с размером 10-40 мкм.

Дня эффективной сорбции патогенов магнитный сорбент активировали с помощью 0,1% раствора поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия. Отмывали и использовали для концентрирования патогенов с последующей постановкой масс-спектрометрии.

Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы в различном аппаратурном исполнении. Нами использован batch-вариант, в котором сорбент помещен в микропробирку, что позволяет патогенам дольше взаимодействовать с ним. В результате взаимодействия патогенов в течение 20±3 мин происходит максимальная адсорбция на сорбенте.

При работе с полученными сорбентами использовали магнитный концентратор. Пробоподготовка состояла из последовательных манипуляций: в микропробирку с 50 мкл активированных магнитных сорбентов вносили 100 мкл микробной взвеси, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от нес вязавшихся антигенов и вносили на 10 мин элюирующий раствор - 0,03 М раствор KOH, затем переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку.

Параллельно проводили постановку контрольных проб: контроль магнитных сорбентов (без инкубации с микробной взвесью) и контроль микробной взвеси (отсутствие магнитных сорбентов).

Согласно методическим рекомендациям (MP 4.2.0089-14) экстракцию белков проводят с использованием 80% раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). В связи с этим, нами апробирован данный вариант использования ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF проводили по традиционной схеме, с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных.

Эксперименты проводились как с чистыми культурами, так и контаминированными пробами. В результате, получены идентичные положительные данные.

Частицы сорбента имеют высокую магнитную восприимчивость. Их преимущество на стадии пробоподготовки для извлечения и концентрирования патогенов из сложных объектов заключается в том, что разделение можно осуществить в одну стадию с помощью магнита, без центрифугирования или фильтрации. Для лучшего взаимодействия патогенов с сорбентами проведена их модификация с использованием катионного поверхностно-активного вещества (ПАВ).

Сконструированные сорбенты механически прочны, химически стабильны, устойчивы к действию микроорганизмов, не набухают в растворителях, обладают высокой проницаемостью для элюатов. Наличие магнитного материала обеспечивает упрощение, ускорение манипуляций с сорбентами.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие преимущества: используемые реактивы отечественного производства, недороги и доступны, способ обеспечивает экологически безопасную технологию получения магнитных сорбентов с сокращением трудовых и материальных затрат (нет необходимости в колонках, дополнительных реагентах), позволяет наладить промышленное производство высокоактивных, специфических препаратов для пробоподготовки патогенов с последующей постановкой масс-спектрометрического анализа без предварительного посева исследуемого материала.

Применение разработанных магнитных сорбентов позволит идентифицировать микст-инфекции, которые часто встречаются в окружающей среде.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Способ получения сорбента включал окисление сульфата железа (II) - FeSO₄ с использованием нагретого гидроксида калия (KOH). Синтез проводили следующим образом: 2,5 г FeSO₄, растворенного в 25 мл дистиллированной воды, в течение 1 мин добавляли к 50 мл кипящего 5% раствора КОН. По окончании процесса окисления осадок отделяли от маточного раствора, отмывали дистиллированной водой до прозрачного надосадка.

К полученному в результате синтеза гидроксиду железа вносили 30 мл 50% раствора полиглюкина. Перемешивали и проводили гелеобразование в течение 2 ч при температуре 22±4°С. Разливали в фарфоровые чашки и прокаливали в течение 20-30 мин при температуре 110-120°С. Измельчение частиц проводили на планетарной шаровой мельнице «Fritsch Р-7» в течение 1 мин, получая магнитные частицы с размером 10-40 мкм.

Сорбент активировали с помощью 0,1% раствора поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфат натрия, отмывали и использовали для концентрирования туляремийного микроба, с последующей постановкой масс-спектрометрии.

Пробоподготовку осуществляли batch-методом, используя магнитный концентратор. В микропробирку с 50 мкл активированных магнитных сорбентов вносили 100 мкл взвеси туляремийного микроба Francisella (F.) tularensis 15 НИИЭГ (тест-штамм) в концентрации 1×10⁶ м.к./мл, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий буфер - 100 мкл 0,03 М раствор KOH на 10 мин, после чего переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген туляремийного микроба) в чистую микропробирку.

Аналогичные процедуры проводили с контаминированными F. tularensis 15 НИИЭГ пробами окружающей среды.

Параллельно проводили постановку контрольных проб: контроль магнитных сорбентов (без инкубации со взвесью туляремийного микроба) и контроль взвеси туляремийного микроба F. tularensis 15 НИИЭГ (без магнитных сорбентов).

Экстракцию белков осуществляли с использованием 80% раствора ТФУ. Далее постановку анализа MALDI-TOF проводили по традиционной схеме (MP 4.2.0089-14) с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных F. tularensis. В результате установлено совпадение спектров экспериментальных образцов с базой данных, при отсутствии совпадения спектров с референтными спектрами гетерологичных штаммов.

Пример 2. Способ получения и активирования сорбента проводили аналогично примеру №1 с последующим применением его для концентрирования возбудителя чумы на магнитном сорбенте.

Пробоподготовку осуществляли batch-методом, используя магнитный концентратор. В микропробирку с 50 мкл активированных магнитных сорбентов вносили 100 мкл взвеси чумного микроба Yersinia (Y.) pestis EV НИИЭГ (вакцинный штамм) в концентрации 1×10⁶ м.к./мл, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий буфер - 100 мкл 0,03 М раствора KOH на 10 мин, после чего переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген чумного микроба) в чистую микропробирку.

Аналогичные процедуры проводили с контаминированными Y. pestis EV НИИЭГ пробами окружающей среды.

Экстракцию белков проводили с использованием 80% раствора ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF осуществляли по традиционной схеме с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных Y. pestis. В результате установлено совпадение спектров экспериментальных образцов с базой данных, при отсутствии совпадения спектров с референтными спектрами гетерологичных штаммов.

Пример 3. Способ получения и активирования сорбента проводили аналогично примеру №1 с последующим применением его для сорбции возбудителя сибирской язвы.

Пробоподготовку осуществляли batch-методом, используя магнитный концентратор. В микропробирку с 50 мкл активированных магнитных сорбентов вносили 100 мкл взвеси сибиреязвенного микроба Bacillus (В.) anthracis СТИ-1 (вакцинный) в концентрации 1×10⁶ м.к./мл, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий буфер - 100 мкл 0,03 М раствор KOH на 10 мин, после чего переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген сибиреязвенного микроба) в чистую микропробирку.

Аналогичные процедуры проводили с контаминированными В. anthracis СТИ-1 пробами окружающей среды.

Параллельно проводили постановку контрольных проб: контроль магнитных сорбентов (без инкубации со взвесью сибиреязвенного микроба) и контроль взвеси сибиреязвенного микроба В. anthracis СТИ-1 (без магнитных сорбентов).

Экстракцию белков проводили с использованием 80% раствора ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF осуществляли по традиционной схеме, с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных В. anthracis. В результате установлено совпадение спектров экспериментальных образцов с базой данных, при отсутствии совпадения спектров с референтными спектрами гетерологичных штаммов.

Используемая литература

1. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в протеомном анализе (обзор) / Н.В. Краснов, Я.И. Лютвинский, Е.П. Подольская // Научное приборостроение. - 2010. Т. 20, №4. - С. 5-20.

2. Тюменцева И.С., Курчева С.А., Афанасьев Е.Н., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Старцева О.Е., Гаркуша Ю.Ю., Семирчева А.А. Особенности пробоподготовки с использованием иммуномагнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы Военно-медицинский журнал. - 2018. - Т. 339, №5. - С. 42-46.

3. Патент №2424192, C02F 1/28, D01J 20/04, C01F 5/14, опубл. 21.07.2011.

4. Patent US 7291578, Hybrid anion exchanger for selective removal of contaminating ligands from fluids and method of manufacture thereof. B2, Int. C1. B01J 20/26, 2007.

5. Шабанова, H.A. Химия и технология нанодисперсных оксидов / Н.А. Шабанова, В.В. Попов, П.Д. Саркисов. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 309 с.

6. Novel high dielectric constant nanocomposites of polyaniline dispersed with γ-Fe₂O₃ nanoparti-cles / N.N. Mallikarjuna, S.K Manohar, P.V. Kulkar ni et al. // J. Appl. Polym. Sci. - 2005 - V. 97, №5. - P. 1868-1874.