Результат интеллектуальной деятельности: Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а также к практике ветеринарной службы.

Известен способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (патент РФ №2521330, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2013 г.), включающий выделение ДНК вируса лейкоза из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением последовательно 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала и сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Известно использование для диагностики эндогенного внутреннего контроля, для снижения доли ошибочных результатов ПЦР в тест-системе «ЛЕЙКОЗ» для выявления вируса лейкоза КРС методом ПЦР (http://www.interlabservice.ru/upload/iblock/195/Leykoz.MANUAL.150413.pdf, 2015 г.).

В качестве такого контроля используют фрагмент гена α-актина КРС с присутствием специфической полосы на электрофореграмме на уровне 582 п.н.

Недостатком применения фрагмента гена α-актина КРС в качестве эндогенного внутреннего контроля является то, что он не является видоспецифичным для КРС, так как встречается и у других видов животных и имеет высокий уровень структурного сходства (более 90% идентичности) у разных видов позвоночных животных. Это снижает надежность его использования в целях внутреннего контроля ПЦР при исследовании биологического материала для выявления вируса лейкоза КРС, поскольку не дает достаточных оснований утверждать, что в исследуемом образце амплифицируется именно фрагмент ДНК КРС.

Наиболее близким техническим решением является изобретение (патент РФ №2700245, кл. C12Q 1/68, 2019 г.) включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, положительных и отрицательных контролей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4, со следующими нуклеотидными последовательностями:

измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный.

Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания животного происхождения.

Техническим результатом заявляемого технического решения является получение достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания и в сырье для их приготовления животного происхождения.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием положительных и отрицательных контролей, внутреннего экзогенного контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4, специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и генома бактериофага Т4, а также олигонуклеотидных праймеров, зондов со следующими нуклеотидными последовательностями:

измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению в качестве биологического материала используют пробы продуктов и сырья животного происхождения, а в смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4 добавляют фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота, который используют в качестве эндогенного внутреннего контроля с праймерами, имеющими следующие нуклеотидные последовательности:

при этом все фрагменты геномов и ген бета-актина крупного рогатого скота, входящие в смесь положительного контрольного образца взяты в равных частях, а для эндогенного внутреннего контроля используют флуоресцентный краситель - ROX.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для повышения точности выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания животного происхождения используют фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота в качестве эндогенного внутреннего контроля.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной службе, для выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания осуществляют следующим образом

Предварительно сорбционным методом выделяют из биологического материала, в качестве которого использованы пробы продуктов питания или сырья для их приготовления животного происхождения геном провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), взятый от животных.

Далее проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, положительных и отрицательных контролей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), фрагмент генома бактериофага Т4 и фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота, который используют в качестве эндогенного внутреннего контроля, при этом все фрагменты геномов и гена, входящие в смесь положительного контрольного образца взяты в равных частях со следующими нуклеотидными последовательностями:

Затем измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, а для эндогенного внутреннего контроля используют канал - ROX/Orange, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный.

Ген бета-актина является белком, синтезирующийся практически во всех клетках организма и отвечающий за их подвижность.

Использование для положительного контрольного образца гена бета-актина крупного рогатого скота в качестве эндогенного внутреннего контроля обусловлено тем, что обеспечивается возможность контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для ДНК Bovine leukosis virus были отобраны на основе консервативного участка гена "pol" (Bovine leukemia virus complete genome, AF033818.1) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). С помощью BLAST праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI. Расчетная длина специфического фрагмента составила 98 пар нуклеотидов.

Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд TMBLV-P (комплементарный участку нук-леотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров TMBLV-F и TMBLV-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3"-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".

В качестве внутреннего контрольного образца использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для использования в качестве эндогенного внутреннего контроля разработаны праймеры на участок гена бета-астина, на основе референсной последовательности NCBI [ВТ030480 1776 bp mRNA linear МАМ 04-MAY-2007 DEFINITION Bos taurus actin, beta (ACTB), mRNA, complete cds.]. Зонд на 3'-конце помечен флуоресцентным красителем РОХ. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда (АС-Р) поставлен гаситель BHQ-2.

Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания

Список сокращений, используемых в примере:

ВКО - внутренний контрольный образец

К- - отрицательный контроль

ВК- - отрицательный контроль этапа экстракции

К+ - положительный контроль

ОКО - отрицательный контрольный образец

ПКО - положительный контрольный образец

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция с флуоресценной детекцией в режиме реального времени

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

НК - нуклеиновая кислота

BLV - Bovine leukosis virus

Для исследования пробы продуктов или сырье для их приготовления животного происхождения, гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об./мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции НК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения НК.

Молоко в объеме до 10 мл центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.

Затем проводят исследование с помощью наборов реагентов «ПЦР-ЛЕЙКОЗ-FOOD-ФАКТОР», состоящие из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР РВ (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Набор выпускается в двух вариантах:

• Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы).

• Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используются в соответствии инструкции ТУ 21.10.60-250-51062356-2021 Для диагностики in vitr (http://www.vetfaktor.ru/.)

Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.

В набор не входят реактивы для экстракции нуклеиновых кислот.

Выделение ДНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, и также наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Исследования состоят из 3-х этапов:

- экстракция НК;

- проведение ПНР РВ;

- учет результатов анализа.

Для экстракции ДНК из продуктов питания рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-ПЛАНТ-ФАКТОР» по инструкции (или аналогичный) https://www.vetfaktor.ru/products/nabory-dlya-vydeleniya-nk/gmo-s-factor-kat-edp001-vet-55-prob.html.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Внести во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО BLV-F (суспензия бактериофага Т4). Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения (ВК-) вместо исследуемой пробы внести ОКО² (Вместо ОКО допускается использование физиологического раствора, ТЕ-буфера, дистиллированной воды. Реагенты должны быть чистыми и стерильными. Запрещается использовать забуференный физиологический раствор!) (пробирку обозначить как ВК-).

Выделять НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Для проведения ПЦР осуществляют подготовку образцов, при этом общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО BLV-F, ВКО BLV-F и ДНК буфера.

В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ BLV-F;

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР BLV-F;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешать смесь на вортексе и сбросить капли кратковременным центрифугированием.

Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Внести по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);

в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BLV-F.

Далее проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q».

Параметры температурно-временного режима амплификации на этом приборе представлены в таблице 3.

Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя этого прибора.

Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE(HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации (рекомендуется поставить смывы).

Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 32 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Если для выделенных образцов по каналу ROX/Orange значение Ct отсутствует или превышает 32 цикл, повторно проводят исследования с этапа выделения ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов может указывать на не корректный забор материала и отсутствие ДНК КРС.

Образец считается положительным (ДНК провируса лейкоза КРС присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК провируса лейкоза КРС отсутствует), если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналам ROX/Orange и FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).

Для доказательства эффективности выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом. Оказалось, что чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении ДНК провируса лейкоза КРС в продуктах питания на 2,8-3,4% выше, чем в прототипе.