Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики грибных болезней земляники садовой

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к садоводству, и может быть использовано для ранней диагностики грибных болезней земляники садовой при проведении мероприятий по ее защите.

Земляника садовая - широко распространенная ягодная культура, отличающаяся способностью к быстрому вегетативному размножению, скоро-плодностью, урожайностью, высокой пластичностью. Земляника вкусна и полезна. Ягоды содержат комплекс жизненно необходимых для организма человека биологически активных и легко усваиваемых веществ [Инновационные технологии возделывания земляники садовой: науч.-практ. изд. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2010. - 88 с.].

Одним из сдерживающих факторов производства земляники является поражение возделываемых сортов грибными болезнями, что приводит к снижению продуктивности плантаций от 15 до 92%, а подчас и к их гибели. Наиболее распространенными грибными болезнями являются белая, бурая и угловатая пятнистости [Говорова Г.Ф., Говоров Д.Н. Грибные болезни земляники садовой, селекция на иммунитет и другие методы защиты: Монография. - М.: Издательство РГАУ-МСХА, 2015. - 168 с.]. Диагностика болезней и их возбудителей - важное звено в системе защиты растений, особенно востребована на ранней стадии развития болезни. Визуальная диагностика не теряет своей актуальности, так как часто является предварительной для других диагностических технологий. Основными недостатками визуального метода можно считать ненадежность, обусловленную совпадением внешних признаков поражения растений грибными болезнями и физиологических нарушений, вызванных неблагоприятными внешними воздействиями, необходимость высокой квалификации эксперта и поздний факт обнаружения болезней. Внешние признаки болезни не всегда бывают четко видимыми. Проявление болезни усиливают, например, методом влажной камеры, который основан на стимуляции развития и роста грибов в пораженных образцах, для чего создают определенные условия температуры и влажности. [Москвичев А.Ю. Фитосанитарный контроль растений: учебное пособие / А.Ю. Москвичев, Т.Л. Карпова, Т.В. Константинова, И.А. Корженко, А.С. Межевова. - Волгоград: ФГБОУ ВПО Волгоградский ГАУ, 2015. - 132 с.]. Известен также способ устранения запаздывания экспертизы путем нанесения на поверхность листьев различных химических соединений, ускоряющих проявления окрашенных очагов патогена. Способ позволяет производить более раннюю диагностику состояния растений [Патент РФ 2127969, МПК A01G 7/00 Способ заблаговременного прогноза грибных болезней растений / П.Г. Чмырь, Д.А. Колесова. - Заявка 96111712/13; заявл. 10.06.1996; опубл. 27.03.1999, Бюл. №4]. Но эти способы неэффективны из-за трудоемкости и длительности процедур, а также необходимости учета погодных условий и создания обособленных химических веществ - «проявителей» для различных грибных болезней растений. Технологии с использованием методов визуального осмотра перспективны в сочетании с микроскопированием для предварительных предположений о возможных возбудителях [Федоренко В.Ф., Мишуров Н.П., Неменущая Л.А. Перспективные технологии диагностики патогенов сельскохозяйственных растений: науч. аналит. обзор. - М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2018. - 68 с.]. Спороношения и иные образования грибов при этом рассматривают с помощью микроскопа, пользуясь для приготовления микропрепаратов различными методиками (метод снятия, среза, выкалывания) [Москвичев А.Ю. Фитосанитарный контроль растений: учебное пособие / А.Ю. Москвичев, Т.Л. Карпова, Т.В. Константинова, И.А. Корженко, А.С. Межевова. - Волгоград: ФГБОУ ВПО Волгоградский ГАУ, 2015. -132 с.]. Технология диагностики возбудителей болезней с помощью выделения в чистую культуру с последующим микробиологическим исследованием является дешевым, но трудоемким методом, занимает много времени, имеет низкую производительность. Зависимость от морфологического определения требует от исследователя обширных знаний классической таксономии. Более совершенны методы, основанные на молекулярной биологии и иммунологии: различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод иммуноферментного анализа (ИФА), молекулярно-гибридизационный анализ (МГА), иммунохроматография (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках) [Федоренко В.Ф., Мишуров Н.П., Неменущая Л.А. Перспективные технологии диагностики патогенов сельскохозяйственных растений: науч. аналит. обзор. - М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2018. - 68 с.]. Однако данные методы требуют использования сложного дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного технического обслуживания. Кроме того, эти методы длительны и инвазивны. Известен более простой способ определения функционального состояния биологической ткани путем измерения ее полного электрического сопротивления (биоимпеданса) или его отдельных составляющих на низкой и высокой частоте и определения их отношения -коэффициента дисперсии [Торнуев Ю.В. Хачатрян А.П., Хачатрян Р.Г., Махнев В.П., Осенний А.С.Электрический импеданс биологических тканей. - М.: ВЗПИ, 1990. - 155 с.; Патент РФ №2102006, МПК А61В 5/05 Способ оценки состояния биологических тканей и устройство для его реализации / А.П. Хачатрян, Р.Г. Хачатрян, Г.Л. Верещагин. - Заявка №96120297/14; заявл. 21.10.1996; опубл. 20.01.1998]. Рассматриваемый способ универсален и достаточно распространен. С помощью этого способа определяют общее функциональное состояние живого организма, его тонус и жизнеспособность [Тарусов Б.Н. Биофизика. - М.: Высшая школа. - 1968. - 468 с.; Алейников А.Ф., Осенний А.С., Верещагин Г.Л. Портативный кондуктометр "Тонус-2" // Контроль и диагностика сельскохозяйственных объектов: Сб. науч. трудов. -Новосибирск. - 1981. - С.16-22], оценивают качество продуктов животного и растительного происхождения [Патент РФ №2552665, МПК G01N 33/12 Способ определения качества мяса / А.Ф. Алейников, И.Г. Пальчикова, В.Г. Гляненко, Ю.В. Чугуй. - Заявка №2013155421/15; заявл. 12.12.2013; опубл. 10.06.2015, Бюл. №16], а также физиологическое состояние растения [Патент РФ №2595850, МПК G01N 33/00 Способ диагностики срезанных зеленых черенков для прогнозирования их укореняемости / В.В. Минеев, А.Ф. Алейников, В.А. Золотарев, О.В. Елкин. - Заявка №2015126192/15; заявл. 30.06.2015; опубл. 27.08.2016, Бюл. №24]. Но с помощью этого способа трудно обеспечить достоверную идентификацию всего комплекса болезней (грибных, бактериальных, вирусных). Известен способ определения устойчивости растения к изменению фактора внешней среды, включающий измерение поляризационного сопротивления ткани растения. Об устойчивости растения к изменению фактора внешней среды судят, сравнивая значения внешнего фактора для контрольного и исследуемого растений, соответствующие моменту резкого уменьшения поляризационного сопротивления [А.с. СССР 1123586, МПК A01G 7/00 Способ определения устойчивости растения к изменению фактора внешней среды / Ф.Г. Олоер, В.Н. Лысиков. - Заявка №360695/30-15; заявл. 16.06.1983; опубл. 15.11.1984, Бюл. №42]. Этот способ реализуется с помощью измерительного моста, к которому посредством неполяризующих-ся электродов подключают исследуемый объект. В одну из диагоналей моста подают переменный ток, состоящий из тока высокой частоты (1 МГц) и низкой частоты (10 кГц), с другой диагонали моста электрические сигналы разделяют избирательными усилителями, раздельно демодулируют по фазе и амплитуде и обрабатывают на двух специальных устройствах экстремального уравновешивания измерительного моста по активному и реактивному сопротивлениям. Данный способ не обеспечивает достаточной точности измерений поляризационного сопротивления. Действительно, небольшое несоответствие значений параметров элементов плеч измерительного моста их номинальным значениям и изменение сопротивлений соединительных проводов, изоляции, наличие емкостных связей элементов моста между собой и с внешними предметами приводят к значимым погрешностям измерений сопротивления [Туричин A.M., Новицкий П.В., Левшина Е.С. Электрические измерения неэлектрических величин. - Л.: Энергия. - 1975. - 576 с.]. Наиболее близким аналогом изобретению (прототипом) по технической сущности является способ обнаружения грибных болезней земляники садовой, при котором осуществляют наложение неполяризующихся электродов на листья растений, измерение и запоминание реактивного сопротивления растительной ткани здорового листа Х₀ на фиксированной частоте ƒ₀, расположенной в области α-дисперсии биоимпеданса ткани. Затем повторяют вышеописанную процедуру измерения и запоминания реактивного сопротивления растительных тканей X_i на той же частоте ƒ₀ на диагностируемых листьях земляники выбранного сорта с предполагаемым поражением грибной болезнью и определяют коэффициент поражения k_i=X_i/X₀ и, если k_i ≥ 1,1, считают, что данное растение подвержено действию биострессора - возбудителя грибных болезней. При этом фиксированную частоту ƒ₀ выбирают в диапазоне от 800 до 1200 Гц [Патент РФ №2714324, МПК A01G 7/00, G01N 27/00 Способ обнаружения грибных болезней земляники / А.Ф. Алейников, В.В. Минеев. - Заявка №2019120719; заявл. 01.07.2019; опубл. 14.02.2020, Бюл. №5]. Достоинством способа является объективная количественная оценка степени поражения. Недостаток способа - относительно низкая чувствительность, так как при коэффициенте поражения k_i ≥ 1,1 степень поражения листовой поверхности уже достаточно высока (больше 3-5%).

Техническим результатом при осуществлении заявляемого способа является повышение чувствительности информативного параметра к степени поражения листовой поверхности земляники садовой грибной болезнью.

Технический результат в изобретении достигается тем, что в способе диагностики грибных болезней земляники садовой, включающем последовательные измерения в диапазоне частот в области α-дисперсии биоимпеданса растительной ткани, путем наложения неполяризующихся электродов на листья растений, реактивной составляющей биоимпеданса растительной ткани, расположенной в зоне этих электродов, здорового и диагностируемого листа земляники того же сорта с предполагаемым поражением грибной болезнью, по данным измерений и математической зависимости реактивной составляющей импеданса эквивалентной электрической схемы замещения растительной ткани от частоты, которую предварительно получают по правилам последовательного и параллельного соединения активных и реактивных сопротивлений элементов схемы замещения, определяют последовательно для здорового и диагностируемого листа емкость конденсатора эквивалентной электрической схемы замещения растительной ткани, моделирующего емкость мембран растительных клеток, затем определяют отношение емкостей конденсаторов, полученных для здорового и диагностируемого листьев, и по его отклонению от единицы в сторону увеличения судят о степени поражения земляники садовой грибной болезнью, при этом измерения проводят в диапазоне частот от 100 Гц до 10000 Гц.

Такое выполнение способа позволяет с помощью эквивалентной электрической схемы замещения растительной ткани, моделирующей электрические свойства листа, получить из экспериментальной частотной характеристики реактивной составляющей биоимпеданса растительной ткани листа более информативный параметр - емкость конденсатора, являющейся эквивалентом емкости мембран растительных клеток ткани листа земляники. Известно, что мембраны растительных клеток являются диэлектрическими перегородками между проводящими областями - внутриклеточными и межклеточными растворами электролитов - и по электрическим свойствам являются конденсаторами [Гираев М.А. Частотный спектр импеданса биотканей растительного происхождения // Вестник Дагестанского государственного университета. - 2015. - Т. 30. - Вып.6. - С.50-55]. Под действием внешнего электрического поля ионы электролитов перемещаются к поверхности мембран, пока поле накопленных зарядов не уравновесит приложенное внешнее поле, то есть происходит поляризация ткани. Таким образом, емкостная (реактивная) составляющая биоимпеданса участка растительной ткани листа, расположенного между электродами, создается всеми клеточными мембранами, расположенными на пути измерительного тока. Емкость мембран тем больше, чем более молодой и здоровой является ткань растений. При повреждении ткани грибом-возбудителем увеличивается проницаемость мембран, происходит выравнивание ионов натрия и калия по обе стороны мембран, ткань постепенно утрачивает способность к поляризации, и емкость мембран и, соответственно, емкость эквивалентного конденсатора схемы замещения растительной ткани уменьшаются [Тарусов Б.Н. Биофизика - М.: Высшая школа. - 1968 - 468 с.]. При этом емкостная (реактивная) составляющая биоимпеданса растительной ткани листа увеличивается, но ее чувствительность к воздействию возбудителя грибной болезни меньше, так как она зависит не только от емкости мембран, но еще и от активных сопротивлений внутриклеточных и межклеточных жидкостей, а также импеданса электродов. Измерения проводят в диапазоне частот от 100 Гц до 10000 Гц для надежного выявления экстремума реактивной составляющей биоимпеданса растительной ткани.

На чертеже изображена эквивалентная электрическая схема замещения растительной ткани листа земляники садовой, где 1 - конденсатор, емкость С₁ которого моделирует емкость двойного электрического слоя на границе раздела металлических измерительных электродов и листа земляники; 2 -резистор, сопротивление R₁ которого моделирует сопротивление двойного электрического слоя на границе раздела металлических измерительных электродов и листа земляники; 3 - резистор, сопротивление R₂ которого моделирует сопротивление межклеточной и внутриклеточной жидкостей растительных тканей листьев земляники; 4 - конденсатор, емкость С₂ которого моделирует емкость мембран растительных клеток листьев земляники.

Способ диагностики грибных болезней земляники садовой реализуется в последовательности действий, изложенной ниже.

Отбирают микроскопическим или иным общепринятым методом здоровые листья земляники садовой выбранного сорта, прижимают к листовой пластинке с заданным усилием, смазанные электропроводным гелем, неполяризующиеся электроды и подключают их ко входу измерительно-вычислительного устройства, состоящего из импедансметра и блока обработки данных, в котором предварительно записывают программу расчета емкости конденсатора эквивалентной электрической схемы замещения растительной ткани, моделирующей емкость мембран растительных клеток, и программу расчета отношения емкостей конденсаторов, моделирующих емкости мембран растительных клеток здорового и диагностируемого листа. Затем измеряют с определенным шагом по частоте реактивное сопротивление растительной ткани листовой пластинки в диапазоне частот от 100 до 10000 Гц и запоминают его на характеристической частоте, соответствующей максимальному значению реактивного сопротивления растительной ткани. Далее повторяют процедуру измерения и запоминания реактивного сопротивления растительной ткани листовой пластинки диагностируемого растения того же сорта, запускают программу обработки данных измерений и считывают с индикатора измерительно-вычислительного устройства значение отношения емкостей конденсаторов, моделирующих емкости мембран растительных клеток здорового и диагностируемого листьев. По его отклонению от единицы в сторону увеличения судят о степени поражения земляники садовой грибной болезнью.

Для подтверждения способа нами проведено в период с 22.07.2021 по 02.09.2021 его практическое опробование на здоровых и подверженных воздействию грибов Ramularia tulasnei Sacc и Marssonina potentillae Desm - возбудителей белой и бурой пятнистости - листьях земляники садовой сорта Царица, выращенной на биополигоне СибФТИ СФНЦА РАН, расположенном в р.п.Краснообск, Новосибирской области. Географические координаты: широта - 54°55'11'' N; долгота - 82°59'27'' Е; высота над уровнем моря -114,0 м. Земельный участок расположен в лесостепи Новосибирского Приобья. Состав почвы - с преобладанием выщелоченного среднемощного чернозема. Климат - континентальный, умеренно прохладный, умеренно засушливый со среднегодовым количеством осадков 425 мм.

Практическое опробование проводят следующим образом. Из партии растений (кустов) земляники садовой выбранного сорта производят контрольную выборку в количестве не менее 25 растений (каждое растение содержит до 5 ветвей и по 3 листа на ветви). Отбирают необходимое количество здоровых и больных грибной болезнью листьев растений. Здоровые листья определяют микроскопическим методом с помощью трех экспертов. Степень поражения растения определяют в фазе плодоношения путем фотографирования исследуемого листа, получения скана изображения и применения программы для анализа графических файлов с интегрированным редактором - ImageJ, для соответствующей обработки изображения на персональном компьютере. Для исследований выбирают четыре степени поражения поверхности листовой пластинки: 1%; 2%; 3% и 4%.

На листовую пластинку выбранного сорта земляники садовой с двух сторон налагают два неполяризующихся чашечковых электрода H124SG диаметром 8 мм фирмы COVIDIEN (США) с постоянным усилием прижима их к поверхности листовой пластинки, которое обеспечивают с помощью зажимов типа «прищепка». Для уменьшения контактного сопротивления между электродами и поверхностью листовой пластинки электроды смазывают электродным гелем «Акугель-Электро» производства ООО «МедиКрафт» (Россия).

Далее, электроды подключают ко входу прибора «Прецизионный анализатор импеданса WK 6505 В» производства Wayne Kerr Electronics (Великобритания) и проводят измерения реактивных сопротивлений растительной ткани здоровых и больных листьев растений в 100 точках в частотном диапазоне от 100 Гц до 10000 Гц с амплитудами переменного тока не более 10 мкА. При необходимости, для уменьшения случайной составляющей погрешности, измерения повторяют многократно и по методике прямых измерений [ГОСТ 8.207-76. ГСИ. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений] проводят обработку результатов измерений. Значения реактивных сопротивлений растительной ткани на характеристической частоте, на которой реактивное сопротивление максимально, используют для определения емкостей конденсаторов, моделирующих емкости мембран растительных клеток листьев. Для определения емкостей конденсаторов используют электрическую эквивалентную схему замещения растительной ткани листьев земляники (чертеж) и методику расчета ее параметров, предложенные коллективом профессоров ВУНЦ ВВС «ВВА им. профессора Н.Е.Жуковского и Ю.А.Гагарина», государственного университета инженерных технологий и государственного технического университета (г.Воронеж) [Голев И.М., Санин В.М., Титов С.А., Коротков Л.Н. Электрическая эквивалентная схема биологических объектов растительного происхождения. - Вестник ВГТУ, 2013. - Т. 9. - №4. - С. 26-29]. Емкость С₂ конденсатора 4, моделирующую емкость мембран растительных клеток листьев земляники, определяют, сначала для здоровых и затем для диагностируемых листьев, следующим образом. Сначала определяют сопротивление R₂ резистора 3, моделирующее сопротивления межклеточной и внутриклеточной жидкостей растительной ткани листьев земляники по формуле (1):

где Х_mах - максимальное значение реактивной составляющей биоимпеданса растительной ткани листьев земляники, полученное экспериментально. И по формуле (2) определяют емкость С₂ конденсатора 4:

где ƒ_max - характеристическая частота, на которой реактивная составляющая биоимпеданса растительной ткани листьев земляники, полученная экспериментально, имеет максимальное значение Х_mах.

По методике косвенных измерений [МИ 2083-90. ГСИ. Измерения косвенные. Определение результатов измерений и оценивание их погрешностей] определяют отношение емкостей конденсаторов, моделирующих емкости мембран растительных клеток здорового и диагностируемого листьев. По его отклонению от единицы в сторону увеличения судят о степени поражения земляники садовой грибной болезнью.

Результаты определения емкостей С₂ конденсаторов 4 (см. чертеж), моделирующих емкости мембран растительных клеток здоровых и пораженных белой и бурой пятнистостями листьев земляники, и их отношений приведены в таблице.

Из таблицы следует, что информативный параметр - отношение емкостей С₂ конденсаторов 4, моделирующих емкости мембран растительных клеток здорового и диагностируемого листьев - при степени поражения 3-4% находится в пределах от 1,87 до 2,33 и существенно больше, чем в прототипе (от 1,17 до 1,34) и достаточно высок даже при степени поражения 1%.

На основании анализа результатов исследований можно утверждать, что заявляемый способ диагностики грибных болезней земляники садовой имеет высокую чувствительность к последствиям действия возбудителя грибной болезни, не требует много времени и достоверен, имеет широкие функциональные возможности, а также прост в технической реализации. Для реализации способа не обязательно использовать приведенный прецизионный широкополосный анализатор импеданса, который применялся при исследовании ткани листьев земляники садовой. Измерительно-вычислительное устройство для осуществления предлагаемого способа может быть реализовано в микроэлектронном исполнении, например, как описано в публикации [Кузнецов В.В., Новиков А.А. Техническая реализация биоимпедансной поличастотной спектрометрии в диагностических исследованиях // Омский научный вестник. - №2 (120). - 2013. - С.272-277], которое может служить основой для создания автономного, портативного, малогабаритного прибора для неинвазивной диагностики грибных болезней земляники садовой непосредственно на плантациях.

Все данные о состояния ткани здорового растения исследуемых сортов единовременно могут быть занесены в модуль памяти измерительно-вычислительного устройства, и тогда отпадет необходимость периодических измерений реактивного сопротивления на контрольном здоровом листе растений, так как эти значения будут заранее измерены и запомнены для всего многообразия сортов земляники садовой.