Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения экстракта из зерен киноа, обогащенного фитоэкдистероидами

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, а именно к получению обогащенных пищевых продуктов, для повышения адаптационных возможностей организма в условиях стресса, повышения умственной и физической работоспособности, улучшения кратковременной и долговременной памяти, улучшения углеводного и липидного обмена, профилактики и компенсации абдоминального ожирения. Изобретение находит применение в функциональном питании, восстановительной медицине, гериатрии и спорте.

Известно, что современный человек подвергается действию факторов стресса различной природы, силы и продолжительности действия. В регуляции стресса принимает участие гормон стресса кортизол, который в ответ на утомление, физическую нагрузку, голодание, страх и другие экстренные стрессовые ситуации мобилизует в организме метаболические процессы: расщепление белков (в том числе мышечных) до аминокислот, запуск процессов глюконеогенеза в печени, повышение уровня глюкозы в крови, а также накопление жира. Стресс невысокой интенсивности и продолжительности выполняет защитное действие и помогает преодолеть человеческому организму вызовы на стрессовые воздействия. При этом после снятия стрессовой нагрузки уровень кортизола возвращается на базовый уровень. В условиях хронического стресса, когда уровень кортизола постоянно повышен, под его влиянием происходит подавление функций щитовидной железы, повышается артериальное давление, возникает гипергликемия, снижается иммунитет, нарастает количество брюшного жира при нормальной массе тела, уменьшается плотность костей. В свою очередь, это может привести к различным заболеваниям, таким как сахарный диабет, инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз и другие. Многие известные лекарственные средства, направленные на лечение отдельных сердечно-сосудистых заболеваний или нарушений обмена веществ, не устраняют их главную причину, обусловленную хроническим стрессом [Дильман В.М. Большие биологические часы (Введение в интегральную медицину). М: Знание, 1981. 208 с.].

В настоящее время большое внимание уделяется антистрессовой фиторегуляции с применением лекарственных растений, которые эффективны не только для лечения различных заболеваний, но и как метод нормализации физиологических функций и психофизиологического состояния здоровых людей. Показана их эффективность для адаптации организма в ситуациях, как острого стресса, так и длительного воздействия стрессоров, для повышения работоспособности и ускорения восстановления после нагрузок. Для профилактики и коррекции стрессовых состояний, к которым относятся утомление, астения, снижение работоспособности, используются адаптогены - вещества преимущественно растительного происхождения, повышающие неспецифическую устойчивость организма к неблагоприятным стрессовым воздействиям. Адаптогены действуют на центры гормональной регуляции, оптимизируя секрецию кортизола и обеспечивая тонизирующее и стимулирующее действие на функции нервной системы и организма в целом. Они эффективны как на ранней стадии стресса, так и на стадии стрессового истощения, активизируя метаболические процессы. Адаптогены характеризуются также антиоксидантным действием и обеспечивают защиту от повреждения клеточных структур свободными радикалами. Они обладают иммуностимулирующим действием, повышают физическую и умственную работоспособность, устойчивость к различным физиологическим и психологическим стресс-факторам, сокращают сроки адаптации к ним.

Известными адаптогенами являются настойки и препараты на основе женьшеня, элеутерококка, аралии, лимонника, родиолы и некоторых других растений, однако, они имеют противопоказания при бессоннице, повышенной нервной возбудимости и гипертонии [Дырдымов И.В. Женьшень, элеутерококк (к механизму биологического действия). Μ., 1976. 184 с.; Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. СПб., 2007. 129 с.]. Этих недостатков лишены лекарственные препараты и биологически активные добавки на основе растений, содержащих фитоэкдистероиды [Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, 2011. Т. 7. №2, С. 52-59.].

Фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки насекомых, обнаружены во многих видах дикорастущих растений. Фитоэкдистероиды не токсичны для млекопитающих. Выявлено выраженное актопротекторное действие (патент RU №2276991, 2005 A61K 36/21).

Известно гиполипидемическое и противоишемическое средство, представляющее собой экдистероидсодержащую субстанцию смеси 20-гидоксиэкдизона в количестве не менее 75% и 258-инокостерона в количестве не менее 10%, выделенную из надземной части растения серпухи венценосной Serratula coronata L. (Asteraceae). (RU, патент №2337701, 2007, A61K 36/28).

Экдистероиды вводятся в организм в чистом виде или в форме экстрактов растений. Для этого используются лекарственные растения с относительно высоким содержанием экдистероидов, например, левзея сафлоровидная, из корневищ которой получают жидкие и сухие экстракты и выделяют очищенный 20-гидроксиэкдизон в качестве субстанции тонизирующего лекарственного препарата экдистен [Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен-тонизирующее средство в таблетках по 0.005 г // Новые лекарственные препараты.М., 1990. Вып. 6. С. 16-18.].

Для получения биологически активных добавок к пище в последнее время не рекомендовано использование растений, относящихся к списку лекарственных. В этих целях могут быть использованы пищевые растения, однако, примеров известных видов пищевых растений, содержащих фитоэкдистероиды, мало. К ним относятся, например, шпинат и киноа (Chenopodium quinoa Willd.). (Bakrim Α., Maria Α., Sayah F. et al.Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): biosynthesis, transport and regulation of levels //Plant Physiology and Biochemistry, 2008. V. 46. P. 844-854.; Foucault et al A.-S., Even P., Lafont R. et al. Quinoa extract enriched in 20-hydroxyecdysone affects energy homeostasis and intestinal fat absorption in mice fed a high-fat diet // Physiology and Behavior, 2014. V. 128. P. 226-231.).

Киноа или рисовая лебеда (Chenopodium quinoa Willd.), - двудольное растение (класс покрытосеменных растений, у которых зародыш семени имеет две боковые супротивные семядоли), принадлежащее к семейству Chenopodiaceae, является одним из старейших культур в Андском регионе Южной Америки, где выращивается около 7000 лет. Киноа содержит в своем составе большое количество вторичных метаболитов (жирных кислот, флавоноидов, терпеноидов, стероидных и азотосодержащих соединений). Высокое содержание в киноа этих соединений обуславливает ее антидиабетическую, противоопухолевую, антимикробную, противовоспалительную, иммуномодулирующую активность.

Растение киноа обладает высокой пищевой ценностью и целебными свойствами. Зерна киноа содержат много полезных для человеческого организма веществ. Например, витамины Д, С, А, К, Ε и все витамины группы В, магний, марганец, железо, медь, цинк и фосфор. В рационе современного человека должно присутствовать не только сбалансированное количество известных макронутриентов (белков, жиров и углеводов), но и так называемых микронутриентов или минорных компонентов, поступающих с растительной пищей.

Известен функциональный пищевой продукт для снижения избыточной массы тела, содержащий фитоэкдистероиды из пищевого растения киноа, и способ его получения. Содержание фитоэкдистероидов в зернах киноа не выше (0,01-0,02)%. Необходимо потребить не менее 100 г необработанных сухих зерен, чтобы организм человека получил эффективную концентрацию фитоэкдистероидов. Авторами данного изобретения предлагается использовать обогащенный продукт, содержащий в 50 раз больше фитоэкдистероидов, чем исходные зерна киноа. Согласно заявленному способу для получения обогащенного продукта зерна киноа вначале экстрагируют кипящей водой в соотношении 1:4 для удаления сапонинов, придающих экстракту горький вкус. Экдистероиды извлекают из зерен киноа путем вторичной экстракции смесью этанол-вода (1:1) при температуре 80°С. Сухой экстракт обрабатывают абсолютным этанолом. Этанольную фракцию фильтруют и конечный продукт высушивают. Способ предполагает также использование бутанола вместо этанола. Содержание фитоэкдистероидов в обогащенном продукте от 2% до 7%, что на два порядка выше, чем в исходном сырье. Данный обогащенный экстракт добавляют в пищевые продукты, например, йогурты, другие молочные продукты и напитки, или включают в состав желатиновых капсул для получения биологически активных добавок к пище. Согласно патенту в одной капсуле содержится 7,5 мг фитоэкдистероидов. Рекомендуемая доза для профилактики или компенсации абдоминального ожирения составляет 4 капсулы или 30 мг фитоэкдистероидов в сутки. Указанный способ имеет ряд недостатков, таких как использование импортного растительного сырья (зерна киноа), неизбежные потери фитоэкдистероидов на стадии первичной водной экстракции при удалении сапонинов (растворимость фитоэкдистероидов в воде составляет около 2 г/л), применение больших объемов этанола удорожает производство, а использование бутанола нежелательно при получении пищевых добавок (см. патент №2491083, 2008, A61K 36/185).

Заявленный способ, благодаря подобранным приемам и режимам проведения, позволяет получить экстракт из зерен киноа, обогащенный фитоэкдистероидами, с содержанием 20-гидроксиэкдизона до 50 мг/г сухого экстракта, флавоноидов до 240 мг/г в сухом экстракте.

Технической задачей заявленного способа является разработка эффективного метода получения экстракта из зерен киноа, позволяющего увеличить содержание 20-гидроксиэкдизона до 50 мг/г сухого экстракта, флавоноидов до 240 мг/г сухого экстракта. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для повышения адаптационных возможностей организма в условиях стресса, повышения умственной и физической работоспособности, улучшения кратковременной и долговременной памяти, улучшения углеводного и липидного обмена, профилактики и компенсации абдоминального ожирения.

Кроме того, способ получения экстракта из зерен киноа является менее трудоемким и экономически выгодным при сохранении качественных и количественных характеристик конечного продукта.

Техническим результатом заявленного способа является получение экстракта (концентрата) из зерен киноа, обогащенного фитоэкдистероидами (по большей части 20-гидроксиэкдизоном) и флавоноидами.

Технический результат достигается путем получения экстракта из зерен киноа способом, включающим измельчение и просеивание зерен через сито с размерами пор 0,35 мм, затем 2-х этапное экстрагирование на первом этапе, измельченные зерна экстрагируют 500 мл 20-60%-ным раствором этилового спирта и в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно, при комнатной температуре в течение 1 часа осветляют центрифугированием в течение 30 минут (центрифуга BEKMAN J-6B) при скорости 4000 об/мин и отбирают супернатант.на втором этапе полученный осадок экстрагируют 250 мл 20-60%-ным раствором этилового спирта в соотношении 1:10 (г/мл) соответственно, при комнатной температуре в течение 45-60 мин, с последующим центрифугированием, отбирают супернатант и объединяют с полученным на первом этапе, ультрафильтрацию через мембрану с размером пор 10 кД, со сбором низкомолекулярной фракции, которую затем подвергают обратноосмотическому концентрированию с последующем удалением этанола под вакуумом на роторном испарителе, пропусканием этого концентрата через колонку с гидрофобным сорбентом «Диасорб-100 С16» со скоростью элюирования, обеспечивающей прохождение фронта наносимого образца через сорбент в течение 50-60 минут, отмывкой сорбента водой и последующей десорбцией фитоэкдистероидов, флавоноидов и полифенолов 70-75% этиловым спиртом, удалением этанола из спиртового смыва под вакуумом на роторном испарителе и лиофильным высушиванием.

Получаемый экстракт (концентрат) может быть применен в качестве профилактического средства для преодоления негативных последствий стресса, ускорения восстановления после сильных физических и умственных нагрузок, в частности, для людей экстремальных профессий, спортсменов и для лиц, занятых тяжелым физическим трудом, подверженных вредным природным и производственным факторам, пожилым людям, испытывающим состояние хронического стресса.

Способ осуществляется следующим образом

Зерна киноа измельчают и просеивают через сито с размерами пор 0,35 мм. Затем проводят 2-х этапное экстрагирование при перемешивании 20-60%-ным раствором этилового спирта при комнатной температуре в течение 1 часа. На первом этапе проводят экстрагирование измельченных зерен 500 мл 20-60%-ным раствором этилового спирта в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно, при комнатной температуре в течение 1 часа Осветляют путем центрифугирования в течение 30 минут (центрифуга BEKMAN J-6B) при скорости 4000 об/мин и отбирали супернатант. На втором этапе полученный осадок экстрагируют 250 мл 20-60%-ным раствором этилового спирта в соотношении 1:10 (г/мл) соответственно, при комнатной температуре в течение 45-60 мин, с последующим центрифугированием. Отбирают супернатант и объединяют с полученным на первом этапе. Далее проводят ультрафильтрацию объединенного супернатанта в тангенциальном потоке на установке для мембранной фильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 (ВЛАДИСРТ, РФ) через мембрану с диаметром пор 10 кД со сбором низкомолекулярной фракции, которую затем подвергают обратноосмотическому концентрированию с последующем удалением этанола под вакуумом на роторном испарителе, пропусканием этого концентрата через колонку с гидрофобным сорбентом «Диасорб-100 С16» со скоростью элюирования, обеспечивающей прохождение фронта наносимого образца через сорбент в течение 50-60 минут, отмывкой сорбента водой и последующей десорбцией фитоэкдистероидов, флавоноидов и полифенолов 70-75% этиловым спиртом, удалением этанола из спиртового смыва под вакуумом на роторном испарителе и водный раствор фитоэкдистероидов, флавоноидов лиофилизируют (лиофильная сушка ЛС-500, производства ПРОИНТЕХ, РФ).

Содержание 20-гидроксиэкдизона в конечном продукте составляет до 50 мг/г сухого препарата, флавоноидов до 240 мг/г сухого препарата.

ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ

ПРИМЕР 1.

Зерна киноа (25 г) после измельчения и просеивания через сито с размерами пор 0,35 мм на первом этапе зерна экстрагировали 500 мл 20% этилового спирта спирта в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно при комнатной температуре в течение 1 часа, осветляли центрифугированием в течение 30 минут (центрифуга BEKMAN J-6B) при скорости 4000 об/мин и отбирали супернатант. На втором этапе осадок, полученный на первом этапе, повторно экстрагировали 250 мл 20% этилового спирта в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно при аналогичных условиях, центрифугировали, отбирали супернатант и объединяли с полученным на первом этапе.

Объединенный супернатант подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на установке для мембранной фильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 (ВЛАДИСРТ, РФ) через мембрану с диаметром пор 10 кД со сбором низкомолекулярной фракции. Полученный фильтрат концентрировали методом обратного осмоса на установке с фильтром рулонным мембранным «УРФ-1812» и удаляли этанол под вакуумом на роторном испарителе.

После этого полученный концентрат пропускали через колонку с гидрофобным сорбентом «Диасорб-100 С 16» (ЗАО «БиоХимМак», объем 100 мл), со скоростью элюирования, обеспечивающей прохождения фронта наносимого образца через сорбент в течение 60 минут, дальнейшей отмывкой колонки водой и смывом продукта 75% этиловым спиртом. После сбора продукта спирт удалялся на роторном испарителе и водный раствор фитоэкдистероидов, полифенолов и флавоноидов лиофилизовался (лиофильная сушка ЛС-500, производства ПРОИНТЕХ, РФ).

Содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом экстракте составило 36,9±1,8 мг/г, флавоноидов 204,1±10,2 мг/г.Концентрирование 20-гидроксиэкдизона относительно исходного сырья в конечном сухом продукте составило 238 раз.

ПРИМЕР 2.

Зерна киноа (25 г) после измельчения и просеивания через сито с размерами пор 0,35 мм на первом этапе зерна экстрагировали 500 мл 60% этилового спирта в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно при комнатной температуре в течение 1 часа, Затем осветляли центрифугированием в течение 30 минут (центрифуга BEKMAN J-6B) при скорости 4000 об/мин и отбирали супернатант. На втором этапе осадок, полученный на первом этапе, повторно экстрагировали 250 мл 60% этилового спирта при аналогичных условиях, центрифугировали, отбирали супернатант и объединяли с полученным на первом этапе.

Объединенный супернатант подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на установке для мембранной фильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 (ВЛАДИСРТ, РФ) через мембрану с диаметром пор 10 кД со сбором низкомолекулярной фракции. Полученный фильтрат концентрировали методом обратного осмоса на установке с фильтром рулонным мембранным «УРФ-1812» и удаляли этанол под вакуумом на роторном испарителе.

После этого полученный концентрат пропускали через колонку с гидрофобным сорбентом «Диасорб-100 С 16» (ЗАО«БиоХимМак», объем 100 мл), со скоростью элюирования, обеспечивающей прохождения фронта наносимого образца через сорбент в течение 60 минут, дальнейшей отмывкой колонки водой и смывом продукта 75% этиловым спиртом. После сбора продукта спирт удалялся на роторном испарителе и водный раствор фитоэкдистероидов, полифенолов и флавоноидов лиофилизовался (лиофильная сушка ЛС-500, производства ПРОИНТЕХ, РФ).

Содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом экстракте составило 30,8±1,5 мг/г, суммы флавоноидов 170,1±8,2 мг/г,. Концентрирование 20-гидроксиэкдизона относительно исходного сырья в конечном сухом продукте составило 200 раз.

ПРИМЕР 3.

Зерна киноа (200 г) измельчали и просеивали через сито с размерами пор 0,35 мм, после чего проводили экстракцию в два этапа. На первом этапе зерна экстрагировали 500 мл 40% этилового спирта в соотношении 1:20 (г/мл) соответственно при комнатной температуре в течение 1 часа, Затем осветляли центрифугированием в течение 30 минут (центрифуга BEKMAN J-6B) при скорости 4000 об/мин и отбирали супернатант. На втором этапе осадок, полученный на первом этапе, повторно экстрагировали 250 мл 40% этилового спирта при аналогичных условиях, центрифугировали, отбирали супернатант и объединяли с полученным на первом этапе, как описано в примерах 1 и 2. Объединенный супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану с размерами пор 10 кД со сбором низкомолекулярной фракции, которую концентрировали методом обратного осмоса на установке с фильтром рулонным мембранным «УРФ-1812» и удаляли этанол под вакуумом на роторном испарителе.

После этого полученный концентрат пропускали через колонку с гидрофобным сорбентом «Диасорб-100 С 16» (ЗАО«БиоХимМак», объем 100 мл), со скоростью элюирования, обеспечивающей прохождения фронта наносимого образца через сорбент в течение 60 минут, и после отмывки колонки водой смывали полифенолы, фитоэкдистероиды и флавоноиды 75% этиловым спиртом. После сбора продукта спирт удаляли на роторном испарителе и водный раствор лиофилизовали (лиофильная сушка ЛС-500, производства ПРОИНТЕХ, РФ).

Содержание 20-гидроксиэкдизона в полученном конечном продукте составляет 42,9 мг/г сухого вещества, флавоноидов 212,3±7,1 мг/г сухого вещества, концентрирование 20-гидроксиэкдизона относительно исходного сырья составляет 168 раз.