ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТОВ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА С-ТИПА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ ДИСПЛАЗИИ

Область раскрытия

[0001] Раскрытие, в целом, относится к применению вариантов натрийуретического пептида C-типа (CNP) для лечения скелетных дисплазий и к составам пептидов вариантов CNP.

Предпосылки раскрытия

[0002] Семейство натрийуретических пептидов состоит из трех структурно родственных пептидов: предсердного натрийуретического пептида (ANP) (номер доступа GenBank NP_006163, для белка-предшественника ANP, NPPA), натрийуретического пептида головного мозга (BNP) (номер доступа GenBank NP_002512, для белка-предшественника BNP, NPPB) и натрийуретического пептида C-типа (CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990) (номер доступа GenBank NP_077720, для белка-предшественника CNP, NPPC) (J. Hypertens., 10: 907-912 (1992)). Эти небольшие одноцепочечные пептиды (ANP, BNP, CNP) имеют структуру петли из 17-аминокислот (Levin et al., N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)) и играют важные роли во многих биологических процессах. ANP и BNP связываются с рецептором A натрийуретических пептидов (NPR-A), также называемым гуаналилциклазой A (GC-A), и активируют его, что ведет к более высоким уровням внутриклеточного циклического гуанозинмонофосфата (cGMP). Аналогичным образом, CNP взаимодействует с NPR-B (GC-B) для того, чтобы стимулировать образование cGMP (J. Hypertens., 10: 1111-1114 (1992)). Рецептор третьего типа, NPR-C, связывает каждый из натрийуретических пептидов с высокой аффинностью и, в первую очередь, выполняет функцию захвата пептидов из внеклеточного компартмента и направляет пептиды в лизосомы, где они разрушаются (Science, 238: 675-678 (1987)). ANP и BNP образуются в первую очередь в мышечных клетках сердца и, предположительно, играют важные роли в гомеостазе сердечнососудистой системы (Science, 252: 120-123 (1991)). CNP экспрессирован более широко, в том числе в центральной нервной системе, репродуктивном тракте, кости и эндотелии кровеносных сосудов (Hypertension, 49: 419-426 (2007)).

[0003] У человека CNP исходно образуется из гена предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) в виде одноцепочечного препрополипептида из 126-аминокислот (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990)). Удаление сигнального пептида дает pro-CNP, а дальнейшее расщепление с помощью эндопротеазы фурин создает активный пептид из 53-аминокислот (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется с образованием зрелого пептида из 22-аминокислот (CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53 и CNP-22 различаются своим распространением, причем CNP-53 преобладает в тканях, тогда как CNP-22 преимущественно встречается в плазме и цереброспинальной жидкости (J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 26: 269-297 (2006)). Преобладающая форма CNP в хряще неизвестна. Как CNP-53, так и CNP-22 связывается аналогичным образом с NPR-B. Кроме того, оба они индуцируют образование cGMP дозозависимым и схожим образом (VT Yeung, Peptides, 17: 101-106 (1996)).

[0004] Природные гены и полипептиды CNP описаны ранее. В патенте США № 5352770 раскрыт выделенный из головного мозга свиньи и очищенный CNP-22, идентичный по последовательности с CNP человека, а также его использование для лечения при сердечнососудистых показаниях. В патенте США № 6034231 раскрыты ген и полипептид proCNP человека (126 аминокислоты) и ген и полипептид CNP-53 человека.

[0005] Клиренс CNP из внеклеточного пространства происходит под действием мембраносвязанной нейтральной эндопептидазы (NEP), которая быстро разрушает CNP (Biochem. J., 291 (Pt 1): 83-88 (1993)), и через NPR-C, который связывается с CNP и направляет его в лизосомы, где происходит разрушение CNP. Показано, что у нормального человека CNP обладает временем полужизни in vivo 2,6 мин (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Низкая концентрация CNP в плазме (J. Bone Moner. Res., 19 (Suppl. l) S20 (2004)) и его коэкспрессия с NPR-B во многих тканях подсказывает, что CNP действует в первую очередь через аутокринный/паракринный механизм.

[0006] Как изложено выше, CNP связывается с рецептором B натрийуретического пептида (NPR-B), также называемым гуанилилциклазой B (GC-B), и активирует его, что ведет к более высоким внутриклеточным уровням циклического гуанозинмонофосфата (cGMP). Передача сигналов ниже по каскаду, опосредованная образованием cGMP, влияет на ряд разнообразных биологических процессов, которые включают эндохондральную оссификацию. Соответственно, повышенные или пониженные уровни какого-либо из компонентов в этом пути могут вести к аберрантному росту кости или хряща. Например, нокаут CNP или NPR-B в моделях на мышах ведет к животным, которые имеют фенотип задержки роста с более короткими длинными костями и позвонками. Идентифицированы мутации в NPR-B человека, блокирующие надлежащую передачу сигналов CNP, которые ведут к карликовости (Olney, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232 (2006); Bartels, et al., Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34 (2004)). В отличие от этого, мыши, сконструированные для того, чтобы продуцировать повышенные уровни CNP, демонстрируют удлиненные длинные кости и позвонки.

[0007] Ахондроплазия является результатом аутосомной доминантной мутации в гене рецептора 3 фактора роста фибробластов (FGFR-3), которая вызывает отклонение от нормы при формировании хряща. FGFR-3 обычно оказывает негативный регуляторный эффект на рост хондроцитов и, таким образом, рост кости. При ахондроплазии мутантная форма FGFR-3 конститутивно активна, что ведет к резко укороченным костям. Похоже, что происходит нарушение как пролиферации, так и дифференцировки хондроцитов, что ведет к хрящу с удивительно короткой пластинкой роста (P. Krejci et al., J. Cell Sci. 118: 5089-5100 (2005)). Эндохондральная оссификация представляет собой процесс, который управляет продольным ростом длинных костей. Существует четыре зоны пластинки роста - зона покоя, пролиферации, гипертрофии и кальцификации. В пластинке роста NPR-B экспрессируют пролиферативные клетки, тогда как NPR-C экспрессируют гипертрофические клетки (Yamashite et al., J. Biochem. 127: 177-179 (2000)). При нормальном эндохондральном росте кости хондроциты образуют столбики и пролиферируют в зоне пролиферации пластинки роста. Эти столбики дезорганизованы у пациентов с ахондроплазией. Дополнительно, зона гипертрофии находится там, где клетки становятся крупными и в конечном итоге подвергаются апоптозу (лизису), что ведет к инвазии остеоцитов и минерализации. Гипетрофические хондроциты и общий размер зоны у пациентов с ахондроплазией значительно меньше, чем у нормальных пациентов. CNP является агонистом NPR-B, положительным регулятором роста хондроцитов и кости. Передача сигналов CNP/NPR-B ниже по каскаду ингибирует путь FGFR-3 на уровне митоген-активируемой протеинкиназы (MAP K). Ингибирование MAP K содействует пролиферации и дифференцировке хондроцитов в зонах пролиферации и гипертрофии в пластинке роста, что ведет к росту кости.

[0008] У человека активирующие мутации FGFR-3 являются первой причиной генетической карликовости. Мыши с активированным FGFR-3 служат в качестве модели ахондроплазии, наиболее распространенной формы скелетных дисплазий, и сверхэкспрессия CNP спасает этих животных от карликовости. Соответственно, CNP и функциональные варианты CNP являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения различных скелетных дисплазий.

[0009] Терапевтическое применение CNP в настоящее время ограничено его коротким временем полужизни в плазме, которое, как показано, у человека составляет 2,6 минуты in vivo (J Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Для увеличения концентрации CNP выше врожденных уровней (приблизительно 5 пМ), обычно обнаруживаемых в плазме человека, была необходима непрерывная инфузия во всех исследованиях у человека и животных с использованием системно вводимого CNP. Время полужизни CNP в плазме человека снижается с помощью двух механизмов, которые представляют собой разрушение нейтральной эндопептидазой (NEP) и клиренс с помощью рецептора C натрийуретического пептида (NPR-C) (Growth Horm. & IGF Res., 16: S6-S14 (2006)). Вариант CNP, обладающий более длительным временем полужизни in vivo в сыворотке и проявляющий схожую или усовершенствованную активность относительно таковой у CNP дикого типа, является важным для стабильной терапевтической стратегии.

[0010] Оценивали биологические активности различных аналогов и производных CNP. См., например, патент США 7276481, публикацию PCT № WO 94/20534, в которой раскрыта химера из CNP-22 и C-конца ANP из 5-аминокислот, обозначенная как пептид вазонатрин (VNP). В патентах США 8198242 и 8598121 раскрыто использование вариантов CNP для лечения скелетных дисплазий, таких как ахондроплазия. В патентах США 7642243 и 8658373 описано использование вариантов CNP-22 или CNP-53 для лечения артрита.

Краткое раскрытие

[0011] Настоящее изобретение относится к применению пептидов вариантов CNP для того, чтобы лечить скелетные дисплазии, чтобы лечить один или несколько ассоциированных со скелетной дисплазией симптомов или чтобы улучшать одно или несколько последствий или физиологических симптомов скелетной дисплазии у субъекта, страдающего ей, когда пептид варианта CNP вводят выше определенного количества дозы и/или при определенной схеме введения лекарственного средства, как описано в настоящем описании. В настоящем описании изложено, что введение пептидов вариантов CNP может вести к усовершенствованной скорости роста у субъектов с ахондроплазией. В различных вариантах осуществления пептид варианта CNP представляет собой CNP-38 или Pro-Gly-CNP-37.

[0012] В различных вариантах осуществления раскрытие предусматривает способ лечения скелетной дисплазии, который включает введение композиции, содержащей пептид варианта CNP, нуждающемуся в этом субъекту в количестве по меньшей мере 7,5 мкг/кг, где введение лечит скелетную дисплазию или улучшает по меньшей мере один симптом или физиологическое последствие скелетной дисплазии.

[0013] В одном из вариантов осуществления лечение представляет собой улучшение одного или нескольких симптомов скелетной дисплазии, выбранное из группы, состоящей из увеличенного абсолютного роста, улучшенной или увеличенной скорости роста, увеличенной QCT минеральной плотности кости (BMD), улучшения морфологии пластинки роста, увеличенного роста длинных костей, улучшения морфологии позвоночника, улучшенного или увеличенного объема движений в локтевом суставе и сниженного апноэ во сне.

[0014] В одном из вариантов осуществления скелетную дисплазию выбирают из группы, состоящей из ахондроплазии, гипохондроплазии, низкого роста, карликовости, остеохондродисплазий, танатофорной дисплазии, несовершенного остеогенеза, ахондрогенеза, точечной хондродисплазии, гомозиготной ахондроплазии, точечной хондродисплазии, кампомелической дисплазии, врожденной летальной гипофосфатазии, несовершенного остеогенеза перинатального летального типа, синдромов коротких ребер-полидактилии, гипохондроплазии, точечной хондродисплазии ризомелического типа, метафизарной дисплазии Янсена, врожденной спондилоэпифизарной дисплазии, ателостеогенеза, диастрофической дисплазии, врожденной короткой бедренной кости, мезомелической дисплазии Лангера, мезомелической дисплазии Нивергельта, синдрома Робинова, синдрома Рейнхардта, акродизостоза, периферического дизостоза, дисплазии Книста, фиброхондрогенеза, синдрома Робертса, акромезомелической дисплазии, микромелии, синдрома Моркио, синдрома Книста, метатрофной дисплазии и спондилоэпиметафизарной дисплазии. В предпочтительном варианте осуществления скелетная дисплазия представляет собой ахондроплазию.

[0015] Также предусмотрен способ увеличения роста длинных костей у субъекта, который включает введение композиции, содержащей пептид варианта CNP, нуждающемуся в этом субъекту в количестве по меньшей мере 7,5 мкг/кг, где введение увеличивает рост длинных костей. В предпочтительном варианте осуществления субъект имеет ахондроплазию.

[0016] В раскрытии также рассмотрен способ повышения или увеличения скорости роста у субъекта, который включает введение композиции, содержащей пептид варианта CNP, нуждающемуся в этом субъекту в количестве по меньшей мере 7,5 мкг/кг, где введение повышает или увеличивает скорость роста у субъекта. В предпочтительном варианте осуществления субъект имеет ахондроплазию. В различных вариантах осуществления повышение или увеличение скорости роста представляет собой увеличение годовой скорости роста в диапазоне 25%-50% изменения от базового уровня у субъекта. В одном из вариантов осуществления повышение или увеличение скорости роста представляет собой увеличение годовой скорости роста по меньшей мере приблизительно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 40%, изменение от базового уровня у субъекта.

[0017] Предусмотрено, что увеличение скорости роста можно оценивать посредством измерения роста стоя, роста сидя, массы, окружности головы, длины плеча, длины предплечья, длины бедра, длины голени, длины кисти и/или длины ступни.

[0018] В различных способах и композициях, описанных в настоящем описании, пептид варианта CNP можно выбирать из группы, состоящей из:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N); SEQ ID № 1];

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP-37; SEQ ID № 2);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP-37; SEQ ID № 3);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37 (M32N); SEQ ID № 4];

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP-37; SEQ ID № 5);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP-37; SEQ ID № 6); и

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP-37 или CNP-38: SEQ ID № 7).

[0019] В различных предпочтительных вариантах осуществления пептид варианта CNP представляет собой CNP-38 или Pro-Gly-CNP-37.

[0020] В различных способах, описанных в настоящем описании, вводимое количество пептида варианта CNP находится в диапазоне приблизительно от 7,5 мкг/кг приблизительно до 100 мкг/кг, предпочтительно приблизительно от 7,5 мкг/кг приблизительно до 80 мкг/кг, более предпочтительно приблизительно от 7,5 мкг/кг приблизительно до 60 мкг/кг. В различных вариантах осуществления вводимое количество пептида варианта CNP составляет по меньшей мере приблизительно 7,5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 15 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/кг или по меньшей мере приблизительно 60 мкг/кг.

[0021] В различных способах, описанных в настоящем описании, пептид варианта CNP или композицию или состав, содержащие его, вводят подкожно или парентерально, предпочтительно подкожно. Также предусмотрено, что пептид варианта CNP вводят с помощью других путей. Образцовые пути введения включают, но не ограничиваясь этим подкожное, внутрь сустава, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, внутримышечное, внутрикожное, интратекальное, интраперитонеальное, внутримышечное, внутрикожное, интратекальное, топическое, трансдермальное или чресслизистое введение.

[0022] В различных способах, описанных в настоящем описании, пептид варианта CNP или композицию или состав, содержащие его, вводят субъекту в одном лечении или несколькими дозами. Несколько доз можно вводить один раз в сутки или несколькими дозами в течение курса лечения. В различных вариантах осуществления, предусмотрено, что пептид варианта CNP или композицию или состав, содержащие его, вводят, однократной дозой или несколькими дозами, ежедневно, через сутки, каждые 3 суток, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, еженедельно, раз в 2 недели, каждые 3 недели, ежемесячно, каждые 6 недель, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца или другое, как сочтет подходящим лечащий врач. В особенно предпочтительных вариантах осуществления пептид варианта CNP или композицию или состав, содержащие его, вводят субъекту один раз в сутки в течение периода по меньшей мере один месяц, два месяца три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев, девять месяцев, десять месяцев, одиннадцать месяцев, двенадцать месяцев или дольше.

[0023] В определенных вариантах осуществления способов, описанных в настоящем описании, введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, корректируют для того, чтобы сделать возможными периоды предупредительного или терапевтического лечения, после которых следует период восстановления. Например, пептид варианта CNP или композицию или состав, содержащие его, можно вводить внутрь сустава, подкожно, внутривенно или другим способом ежедневно или несколько раз в неделю в течение определенного периода времени, после чего следует период без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах осуществления начальный период лечения (например, введения пептида варианта CNP ежедневно или несколько раз в неделю) составляет 3 суток, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В связанном варианте осуществления период без лечения составляет 3 суток, 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недели. В определенных вариантах осуществления схема дозирования пептида варианта CNP представляет собой ежедневно в течение 3 суток, после чего следует 3 суток отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 1 недели, после чего следуют 3 суток или 1 неделя отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 2 недель, после чего следует 1 или 2 недели отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 3 недель, после чего следует 1, 2 или 3 недели отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель, после чего следует 1, 2, 3 или 4 недели отмены.

[0024] В различных способах, описанных в настоящем описании, предпочтительно, чтобы введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, у субъекта не вызывало или не вело к нежелательному явлению, имеющему степень два или выше. В других вариантах осуществления способов, описанных в настоящем описании, введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, не ведет к клинически значимому изменению концентрации гемоглобина в крови, числа тромбоцитов в крови, концентрации электролитов в крови, концентрации азота мочевины в крови, концентрации креатинина в крови, концентрации щелочной фосфатазы в крови, концентрации аланинаминотрансферазы в крови и/или концентрации аспартатаминотрансферазы в крови у указанного субъекта.

[0025] В различных способах, описанных в настоящем описании, в предпочтительных вариантах осуществления введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, ведет к изменению (i) соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела, (ii) соотношения длины плеча и длины предплечья или (iii) соотношения длины бедра и длины голени между приблизительно -0,25 и приблизительно 0,25, приблизительно -0,20 и приблизительно 0,20, приблизительно -0,15 и приблизительно 0,15, приблизительно -0,10 и приблизительно 0,10 или приблизительно -0,05 и приблизительно 0,05, по сравнению с базовым уровнем (т. е. до введения пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его).

[0026] В различных вариантах осуществления, раскрытие предусматривает композиции или составы, содержащие пептид варианта CNP, или применение композиции или состава, содержащих пептид варианта CNP, в способах, описанных в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления композиция или состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. В определенных вариантах осуществления композицию получают из состава, жидкого или лиофилизированного, который содержит лимонную кислоту/цитратный буфер или уксусную кислоту/ацетатный буфер, имеющий pH приблизительно от 4 приблизительно до 6. В различных вариантах осуществления pH составляет приблизительно 5,5.

[0027] Также предусмотрен способ лечения, как раскрыто в настоящем описании, который дополнительно включает введение второго средства.

[0028] В различных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP, используемые в способах и композициях или составах, описанных в настоящем описании, можно прикреплять к гидрофобной кислоте и можно прикреплять к одной или нескольким гидрофобным кислотам. Неограничивающие примеры гидрофобных кислот включают неразветвленные или разветвленные, насыщенные или ненасыщенные C₅-C₁₂ карбоновые кислоты (например, валериановую кислоту, гептановую кислоту и т. д.) и природные жирные кислоты. Гидрофобные кислоты можно прикреплять к N-концу, C-концу и/или боковой цепи одного или нескольких аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления гидрофобные кислоты конъюгируют с N-концом.

[0029] В еще одном другом варианте осуществления пептиды вариантов CNP, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, представляют собой химерные или слитые белки, которые содержат пептид варианта CNP и отщепляемый пептид или белок или пептидную метку. Образцовые отщепляемые белки или пептиды включают, но не ограничиваясь этим, гистидиновые метки (например, 6-His); TAF12: фактор транскрипции TAF12 человека; KSI: кетостероидизомеразу; MBP: мальтозусвязывающий белок; β-Gal: β-галактозидазу; GST: глутатион-S-трансферазу; Trx: тиоредоксин; CBD: хитинсвязывающий домен; BMPM: мутацию BMP-2, SUMO, CAT, TrpE, стафилококковый белок A, стрептококковые белки, крахмалсвязывающий белок, целлюлозусвязывающий домен эндоглюканазы A, целлюлозусвязывающий домен экзоглюканазы Cex, биотинсвязывающий домен, recA, Flag, c-Myc, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок, биотин, авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их фрагменты.

[0030] В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, пептид варианта CNP может представлять собой мономер или димер. В связанном варианте осуществления мономеры димерных пептидов вариантов CNP можно прикреплять N-концом к N-концу через линкер или без линкера, N-концом к C-концу через линкер или без линкера или C-концом к C-концу через линкер или без линкера.

[0031] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, пептиды вариантов CNP могут иметь по существу ту же или улучшенную биологическую активность, чем CNP-22 дикого типа. Например, пептиды вариантов CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активности CNP-22 дикого типа или могут иметь более высокую активность, чем CNP-22, например, в отношении взаимодействия с NPR-B (GC-B), чтобы стимулировать образование cGMP. Альтернативно, или кроме того, пептиды вариантов CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активности CNP-22 дикого типа или могут иметь более высокую активность, чем CNP-22, в отношении регуляции эндохондрального роста кости и активности хондроцитов, включая в качестве неограничивающих примеров пролиферацию хондроцитов, дифференцировку хондроцитов, ингибирование пути передачи сигнала киназы митоген-активируемого белка (MAP)/киназы MEK (Raf-1) и содействие эндохондральной оссификации. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, пептиды вариантов CNP могут содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше идентична или гомологична аминокислотам 6-22 или 1-22 из CNP-22 дикого типа.

[0032] В различных вариантах осуществления, пептиды вариантов CNP необязательно могут иметь конъюгат(ы) или продолжение(я), например, на N- и/или C-конце для того, чтобы содействовать направленному воздействию на хрящ, снижать почечный клиренс и/или увеличивать устойчивость к NEP разрушению. Такие конъюгат(ы) или продолжение(я) могут содержать молекулы или последовательности, сформированные или полученные, например, из поли Asp, поли Glu, нацеленных на хрящ пептидов, сиалопротеина, PEG, углеводов, гидрофобных кислот, (поли)пептидов из NPPC или не CNP, или их сочетания.

[0033] Кроме того, предусмотрено, что пептиды вариантов CNP можно конъюгировать с гидрофобным полимерным или не полимерным фрагментом, например, таким как гептановая кислота, валериановая кислота или жирные кислоты. Гидрофобный фрагмент можно конъюгировать с боковой цепью аминокислотного остатка, включая в качестве неограничивающих примеров лизин, серин, цистеин или треонин, или можно прикреплять к N-концу и/или C-концу варианта CNP.

[0034] В различных вариантах осуществления, пептиды вариантов CNP, которые можно использовать в способах, имеют pI в диапазоне приблизительно от 8 приблизительно до 10,5 или приблизительно от 8,5 приблизительно до 10.

[0035] В различных вариантах осуществления раскрытие обеспечивает применение фармацевтической композиции, содержащей пептид варианта CNP, необязательно, другое биологически активное средство и, необязательно, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. В различных вариантах осуществления композиции представляют собой стерильные фармацевтические композиции, подходящие для парентеральной инъекции. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат по существу чистый пептид варианта CNP, например, по меньшей мере приблизительно на 90% или 95% чистый. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат меньше чем приблизительно 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% примесей, таких как другие белки человека, белки свиньи или CNP-53 или их фрагменты (отличные от желаемого пептида варианта CNP). В различных вариантах осуществления, стерильную композицию вводят субъекту для лечения или предотвращения скелетной дисплазии или одного или нескольких симптомов или физиологических последствий скелетной дисплазии, описанных в настоящем описании.

[0036] Пептиды вариантов CNP, которые можно использовать в настоящем описании, благоприятно сохраняют активность CNP и демонстрируют увеличенное время полужизни в сыворотке. Сохранение активность CNP можно показывать, например, как сохранение желаемого биологического эффекта in vivo или сохранение по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или по меньшей мере приблизительно 100% стимулирующей cGMP активности у CNP-22, при той же концентрации (например, 1 мкМ пептида CNP или больше ED₈₀). В некоторых вариантах осуществления пептиды вариантов CNP демонстрируют по меньшей мере приблизительно 1,5-кратное, 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 15-кратное, 20-кратное, 25-кратное, 30-кратное, 35-кратное или 40-кратное увеличение времени полужизни в сыворотке по сравнению с CNP-22.

[0037] В связанном варианте осуществления пептиды вариантов CNP, описанные в настоящем описании, обладают увеличенной устойчивостью к NEP и демонстрируют увеличенное время полужизни по сравнению с CNP-22 дикого типа. В одном из вариантов осуществления время полужизни пептидов вариантов CNP увеличивают приблизительно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или приблизительно 100% по сравнению с CNP-22 дикого типа.

[0038] Также предусмотрено применение любого из вышеуказанных пептидов вариантов CNP или композиции, или состава, содержащих его, описанных в настоящем описании при получении лекарственного средства для лечения скелетной дисплазии и симптомов или других физиологических манифестаций, описанных в настоящем описании, связанных со скелетной дисплазии. Также предусмотрены шприцы, например, одноразового применения или предварительно заполненные шприцы, стерильные герметичные контейнеры, например, флаконы, бутылка, сосуд, и/или наборы или упаковки, содержащие любой из вышеуказанных пептидов вариантов CNP или композицию, или состав, содержащие его, необязательно с подходящими инструкциями для применения.

[0039] Также в настоящем описании предусмотрены составы, содержащие (a) пептид варианта CNP, описанный в настоящем описании, и (b) один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из буферного средства, регулирующего изотоничность средства, стабилизатора и средства против адсорбции. В особенно предпочтительных вариантах осуществления буферные средства, используемые в составах, могут представлять собой моногидрат лимонной кислоты, дигидрат цитрата натрия или комбинацию этих двух. В других предпочтительных вариантах осуществления регулирующие изотоничность средства, используемые в составах по настоящему изобретению, могут представлять собой дигидрат трегалозы, D-маннит или комбинацию этих двух. В других предпочтительных вариантах осуществления стабилизатор, используемый в составах по настоящему изобретению, представляет собой L-метионин. В других предпочтительных вариантах осуществления средство против адсорбции, используемое в составах по настоящему изобретению, представляет собой полисорбат 80.

[0040] В различных вариантах осуществления составы по настоящему изобретению представляют собой лиофилизированную, жидкую форму или жидкую форму, которая восстановлена из предварительно лиофилизированной формы. В определенных вариантах осуществления составы по настоящему изобретению не содержат консерванты и, необязательно, их можно содержать в необработанном боросиликатном стеклянном сосуде типа 1. Необязательно составы по настоящему изобретению имеют pH в диапазоне между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,0, предпочтительно приблизительно 5,5.

[0041] В других вариантах осуществления составы по настоящему изобретению содержат пептид варианта CNP в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,0 мг/мл, 5,0 мг/мл, 10,0 мг/мл или выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления состав по настоящему изобретению содержит пептид варианта CNP в концентрации приблизительно 10,0 мг/мл. В особенно предпочтительных вариантах осуществления пептид варианта CNP в составе представляет собой CNP-38 или Pro-Gly-CNP-37.

[0042] В других вариантах осуществления составы по настоящему изобретению содержат пептид варианта CNP, как раскрыто в настоящем описании, моногидрат лимонной кислоты, дигидрат цитрата натрия, дигидрат трегалозы, D-маннит, L-метионин и полисорбат 80. В определенных предпочтительных вариантах осуществления пептид варианта CNP присутствует в концентрации между приблизительно 2,0 мг/мл и приблизительно 10,0 мг/мл, моногидрат лимонной кислоты присутствует в концентрации между приблизительно 0,15 мг/мл и приблизительно 0,40 мг/мл, дигидрат цитрата натрия присутствует в концентрации между приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 1,5 мг/мл, дигидрат трегалозы присутствует в концентрации между приблизительно 30 мг/мл и приблизительно 70 мг/мл, D-маннит присутствует в концентрации между приблизительно 10 мг/мл и приблизительно 20,0 мг/мл, L-метионин присутствует в концентрации между приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 1,5 мг/мл и полисорбат 80 присутствует в концентрации между приблизительно 0,01 мг/мл и приблизительно 0,1 мг/мл. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант CNP присутствует в концентрации приблизительно 10,0 мг/мл, моногидрат лимонной кислоты присутствует в концентрации приблизительно 0,28 мг/мл, дигидрат цитрата натрия присутствует в концентрации приблизительно 1,08 мг/мл, дигидрат трегалозы присутствует в концентрации приблизительно 58,01 мг/мл, D-маннит присутствует в концентрации приблизительно 15,0 мг/мл, L-метионин присутствует в концентрации приблизительно 0,73 мг/мл и полисорбат 80 присутствует в концентрации приблизительно 0,05 мг/мл.

[0043] Содержащие пептид варианта CNP составы, описанные в настоящем описании, являются эффективными, и их можно использовать в различных способах, описанных в настоящем описании.

[0044] Понятно, что каждый признак или вариант осуществления или комбинация, описанные в настоящем описании, являются неограничивающими, иллюстративными примерами любого из аспектов раскрытия и, по существу, подразумевают, что их можно комбинировать с каким-либо другим признаком или вариантом осуществления или комбинацией, описанными в настоящем описании. Например, когда признаки описаны с использованием такой фразы, как «один из вариантов осуществления», «некоторые варианты осуществления», «дополнительный вариант осуществления», «конкретные образцовые варианты осуществления» и/или «другой вариант осуществления», каждый из этих типов вариантов осуществления представляет собой неограничивающий пример признака, который предназначен для комбинирования с каким-либо другим признаком или комбинацией признаков, которые описаны в настоящем описании, без необходимости перечисления каждой возможной комбинации. Такие признаки или комбинации признаков применимы к любым из аспектов раскрытия. Когда раскрыты примеры значений, попадающих в диапазоны, в качестве возможных границ диапазона предусмотрены любые из этих примеров, предусмотрены какие-либо и все числовые значения между такими границами и предусмотрены какие-либо и все комбинации верхних и нижних границ.

Подробное описание раскрытия

[0045] Настоящее изобретение относится к способам применения пептидов вариантов CNP для того, чтобы лечить скелетные дисплазии, один или несколько симптомов или физиологических последствий скелетных дисплазий и другие нарушения, имеющие скелетную дисплазию и/или CNP-ассоциированный симптом или компонент. Настоящее раскрытие также относится к композициям и составам, содержащим пептид варианта CNP, и применению таких композиций или составов для лечения скелетной дисплазии или симптомов или физиологического последствия скелетной дисплазии, увеличения роста длинных костей у нуждающегося в этом субъекта или улучшения или увеличения скорости роста у нуждающегося в этом субъекта, например, у субъекта, страдающего скелетной дисплазией.

A. Определения

[0046] Если не указано иное, следующие термины, используемые в этой заявке, включая описание и формулу изобретения, имеют определения, которые даны далее.

[0047] Как используют в описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа до тех пор, пока контекст явно не диктует иное.

[0048] Термин «приблизительно» обозначает приемлемую ошибку для конкретного значения, как определяет специалист в данной области, которая частично зависит от того, как значение измеряют или определяют. В определенных вариантах осуществления термин «приблизительно» обозначает в пределах 1, 2, 3 или 4 стандартных отклонений. В определенных вариантах осуществления термин «приблизительно» обозначает в пределах 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,05% от данного значения или диапазона. Всякий раз, когда термин «приблизительно» предшествует первому числовому значению в последовательности из двух или больше числовых значений, понятно, что термин «приблизительно» применим к каждому одному из числовых значений в этой последовательности.

[0049] Определение стандартных химических терминов можно найти в справочниках, включая Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3 изд., тома A и B (Plenum Press, New York 1992). При практической реализации настоящего раскрытия можно использовать, если не указано иное, определенные стандартные способы синтетической органической химии, масс-спектрометрии, препаративной и аналитической хроматографии, химии белков, биохимии, технологии рекомбинантных ДНК и фармакологии, в пределах навыков в данной области. См., например, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4-е изд., 2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е изд., 1989); Methods In Enzymology (ред. S. Colowick and N. Kaplan, Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд. (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990).

[0050] Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, выше или ниже, включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.

[0051] Следующие сокращения используют для аминокислот на всем протяжении текста:

[0052] Стандартную систему записи используют в настоящем описании для описания полипептидных и пептидных последовательностей: левый конец полипептидной или пептидной последовательности соответствует амино-концу; правый конец полипептидной последовательности соответствует карбокси-концу.

[0053] В одном из вариантов осуществления пептиды вариантов CNP, описанные в настоящем описании, которые можно использовать в способах, создают с помощью рекомбинантных средств, используя полинуклеотид, кодирующий пептид варианта CNP. Пептиды вариантов CNP, экспрессируемые с помощью таких полинуклеотидов, можно получать с помощью способов, включающих выращивание клеток-хозяев в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант CNP, и выделение продукта экспрессии из клеток-хозяев или среды для культивирования. Фактические продукты экспрессии могут слегка отличаться от кодируемого белкового продукта, в зависимости от какого-либо посттрансляционного процессинга. Способы получения пептидов вариантов CNP по настоящему изобретению раскрыты по меньшей мере в патенте США № 8198242, включенном в настоящее описание посредством ссылки.

[0054] Термины «идентичный» и процент «идентичности», в контексте двух или больше полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, относятся к двум или больше последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают конкретной процентной долей нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством визуального просмотра.

[0055] Фраза «по существу гомологичные» или «по существу идентичные», в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, в целом, относится к двум или больше последовательностям или подпоследовательностям, которые обладают по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством визуального просмотра. В определенных вариантах осуществления существенная гомология или идентичность существует в областях последовательностей, которые составляют по меньшей мере приблизительно 25, 50, 100 или 150 остатков в длину. В другом варианте осуществления последовательности являются по существу гомологичными или идентичными по всей длине любого одного или обоих сравниваемых биополимеров.

[0056] При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выполняет функцию эталонной последовательность, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей в компьютер вводят тестовые и эталонные последовательности, задают координаты подпоследовательностей, в случае необходимости, и задают параметры программы алгоритма последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для тестовой последовательности(ей) относительно эталонной последовательности, на основании заданных параметров программы.

[0057] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), с помощью способа поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444(1988), с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или с помощью визуального просмотра. Одним из примеров эффективного алгоритма является PILEUP, в котором используют упрощение способа прогрессивного выравнивания Feng & Doolittle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 (1987) и который схож со способом, описанным Higgins & Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989). Другим эффективным алгоритмом для генерации множественных выравниваний последовательностей является Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Примером алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915(1989); Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993)). Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST общедоступно через National Center for Biotechnology Information.

[0058] «Дикий тип» (wt) является термином, относящимся к природной форме, включая последовательность, полинуклеотида, полипептида или белка у определенного вида. Форма дикого типа отличается от мутантной формы полинуклеотида, полипептида или белка, возникающего при генетической мутации(ях).

[0059] В одном из вариантов осуществления первый пептид, который является «аналогом» или «вариантом» или «производным» второго пептида, представляет собой пептид, который имеет гомологию последовательностей по меньшей мере приблизительно 50%, 60% или 70%, но меньше гомологии последовательностей 100%, со вторым пептидом. Такие аналоги, варианты или производные могут содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, в том числе, без ограничения, гомоаргинин, орнитин, пеницилламин и норвалин, а также встречающиеся в природе аминокислотные остатки.

[0060] Полипептид предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) представляет собой одноцепочечный препрополипептид из 126 аминокислот, который при расщеплении в конечном итоге ведет к CNP-22 дикого типа (wtCNP-22). Удаление сигнального пептида с NPPC дает pro-CNP, а дальнейшее расщепление с помощью эндопротеазы фурин образует активный пептид из 53-аминокислот (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется с образованием зрелого пептида из 22 аминокислот (CNP или CNP-22). В одном из вариантов осуществления «пептид варианта CNP» по меньшей мере приблизительно на 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% гомологичен NPPC дикого типа на протяжении того же числа аминокислотных остатков. Кроме того, предусмотрено, что пептид варианта CNP может содержать приблизительно от 1 приблизительно до 53, или от 1 до 38, или от 1 до 37, или от 1 до 35, или от 1 до 31, или от 1 до 27, или от 1 до 22, или от 10 до 35 или приблизительно от 15 приблизительно до 37 остатков полипептида NPPC. В одном из вариантов осуществления вариант CNP может содержать последовательность из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 или 53 аминокислот, полученных из полипептида NPPC.

[0061] Термин «эффективное количество» обозначает дозу, достаточную для того, чтобы оказывать желаемый результат на состояние здоровья, патологию или заболевание субъекта или для диагностических целей. Желаемый результат может включать субъективное или объективное улучшение у реципиента дозы. «Терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству средства, которое эффективно оказывает предполагаемый положительный эффект на здоровье. Подходящее «эффективное» количество в каком-либо индивидуальном случае может определять специалист в данной области, используя стандартные эксперименты. Понятно, что конкретный уровень дозы и частота дозы для какого-либо конкретного пациента могут варьировать и будут зависеть от различных факторов, включая активность конкретного используемого соединения; биодоступность, метаболическую стабильность, уровень экскреции и длительность действия этого соединения; способ и время введения соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; и тяжесть конкретного состояния.

[0062] «Лечение» относится к профилактическому лечению или терапевтическому лечению или диагностическому лечению. В определенных вариантах осуществления «лечение» относится ко введению соединения или композиции субъекту в терапевтических, профилактических или диагностических целях.

[0063] «Профилактическое» лечение представляет собой лечение, вводимое субъекту, который не проявляет признаков заболевания или проявляет только ранние только признаки заболевания, с целью уменьшения риска развития патологии. Соединения или композиции по раскрытию можно давать в виде профилактического лечения для того, чтобы снижать вероятность развития патологии или минимизировать тяжесть патологии, в случае развития.

[0064] «Терапевтическое» лечение представляет собой лечение, вводимое субъекту, который проявляет признаки или симптомы патологии с целью уменьшения или устранения этих признаков или симптомов. Признаки или симптомы могут быть биохимическими, клеточными, гистологическими, функциональными или физическими, субъективными или объективными. Соединения по раскрытию также можно давать в качестве терапевтического лечения или для диагностирования.

[0065] «Фармацевтическая композиция» или «состав» относится к композиции, подходящей для фармацевтического применения у животного субъекта, включая человека и млекопитающих. Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество пептида варианта CNP, необязательно другое биологически активное средство и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция охватывает композицию, содержащую активный ингредиент(ы) и инертный ингредиент(ы), который составляет носитель, а также какой-либо продукт, который является результатом, непосредственным или опосредованным, комбинирования, комплексообразования или агрегирования каких-либо двух или больше ингредиентов или диссоциации одного или нескольких ингредиентов или других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему раскрытию охватывают любую композицию, получаемую смешиванием соединения по раскрытию и фармацевтически приемлемого эксципиента, носителя или разбавителя.

[0066] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к любым из стандартных фармацевтических носителей, буферов и т. п., таким как фосфатно-солевой буферный раствор, 5% водный раствор декстрозы и эмульсии (например, эмульсия масло/вода или вода/масло). Неограничивающие примеры эксципиентов включают адъюванты, связывающие средства, наполнители, разбавители, разрыхлители, эмульгирующие средства, смачивающие средства, смазывающие средства, скользящие средства, подсластители, ароматизаторы и красители. Подходящие фармацевтические носители, эксципиенты и разбавители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19-е изд. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Предпочтительные фармацевтические носители зависят от предполагаемого способа введения активного средства. Типичные способы введения включают энтеральное (например, оральное) или парентеральное (например, подкожная, внутримышечная, внутривенная или интраперитонеальная инъекция; или топическое, трансдермальное, или чресслизистое введение).

[0067] «Фармацевтически приемлемая соль» представляет собой соль, которую можно формулировать в соединение для фармацевтического использования, включая в качестве неограничивающих примеров соли металлов (например, натрия, калия, магния, кальция и т. д.) и соли аммония или органических аминов.

[0068] Под «фармацевтически приемлемым» или «фармакологически приемлемым» понимают материал, который не является биологически или иначе нежелательным, т. е. материал можно вводить индивидууму, не вызывая каких-либо нежелательных биологических эффектов или не взаимодействуя вредоносным образом с какими-либо из компонентов композиции, в которой он содержится, или с какими-либо компонентами, присутствующими на или в организме индивидуума.

[0069] «Физиологические условия» относятся к условиям в организме животного (например, человека). Физиологические условия включают, но не ограничиваясь этим, температуру тела и водную среду физиологической ионной силы, pH и ферменты. Физиологические условия также охватывает условия в организме конкретного субъекта, которые отличаются от «нормальных» условий, присутствующих у большинства субъектов, например, которые отличаются от нормальной температуры организма человека приблизительно 37°C или отличаются от нормального pH крови человека приблизительно 7,4.

[0070] Как используют в настоящем описании, термин «субъект» охватывает млекопитающих и не млекопитающих. Примеры млекопитающих включают, но не ограничиваясь этим, любого члена класса млекопитающих: человека, не являющихся человеком приматов, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных обезьян и мартышковых; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши морские свинки, и т. п. Примеры не млекопитающих включают, но не ограничиваясь этим, птиц, рыб и т. п. Термин не обозначает конкретный возраст или пол.

[0071] Термины «полиэтиленгликоль», «PEG», «полиэтиленоксид» и «PEO» используют взаимозаменяемо в настоящем описании, если не указано иное. Вариант CNP, конъюгированный через аминогруппу с полимером «PEOn», ассоциированным с числом n, в целом имеет формулу: CH₃- [-O-CH₂CH₂-]_n-C(=O)- NHR, где n представляет собой число звеньев этиленоксида и R обозначает остальной пептид. Полимер «PEOn» необязательно может иметь алкиленовую группу, (CH₂)_m, где m представляет собой целое от 1 до 5, между карбонильным углеродом и повторяющимися звеньями этиленоксида. Такой полимер «PEOn» (например, PEO12 или PEO24) является монодисперсным, т. е. представляет собой один дискретный полимер конкретной молекулярной массы. Аналогичным образом, вариант CNP, конъюгированный через аминогруппу с полимером «PEGnK», ассоциированным с числом nK, в общем имеет формулу: CH₃- [-O-CH₂CH₂-]_p-C(=O)- NHR, где p представляет собой целое больше 1. Полимер «PEGnK» также необязательно может иметь алкиленовую группу, (CH₂)_m, где m представляет собой целое от 1 до 5, между карбонильным углеродом и повторяющимися звеньями этиленоксида. Однако такой полимер «PEGnK» (например, PEG1K, PEG2K, PEG5K или PEG20K) является полидисперсным, т. е. содержит смесь полимеров, имеющих распределение молекулярных масс, где число nK обозначает среднечисловую молекулярную массу (M_n) полимера в килодальтонах. Например, «PEG2K», конъюгированный с вариантом CNP, обозначает полидисперсный полимер PEG, имеющий среднечисловую молекулярную массу полимера приблизительно 2 кДа.

[0072] Когда приводят (например, в единицах кДа) диапазон массы полимера (например, PEG), диапазон относится к диапазону среднечисловых молекулярных масс полимера, но не к диапазону молекулярных масс нескольких полимеров в полидисперсной смеси, пока явно не указано иное.

B. Пептиды вариантов CNP

[0073] Использование CNP-22 в качестве терапевтического средства ограничено его коротким временем полужизни в плазме (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). В плазме человека концентрация CNP-22 обычно меньше 5 пМ. У человека CNP-22 разрушается и выводится из циркуляции с помощью NEP и NPR-C (Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14). Во всех исследованиях у человека и животных с использованием системно вводимого CNP-22, для увеличения концентрации CNP-22 у субъектов использовали непрерывную инфузию. Пептид CNP, имеющий более длительное время полужизни и по меньшей мере схожий уровень функциональности, будет полезен для терапевтической стратегии на основе CNP. Пептиды вариантов CNP, имеющие улучшенные свойства, раскрыты в международных заявках №№ WO 2009/067639 и WO 2010/135541 и патентах США №№ 8198242, 8598121 и 8377884, все конкретно включены в настоящее описание посредством ссылки.

[0074] В определенных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP представляют собой производные CNP-37 или CNP-38. Пептиды вариантов CNP-37 могут содержать добавление(я), делецию(и) и/или замену(ы) аминокислоты на природную или не природную аминокислоту(ы) или пептидомиметик(и) (например, изостер(ы) по пептидной связи) в каком-либо одном или нескольких из 37 положений в CNP-37. Неограничивающие примеры замен, которые можно выполнять в CNP-37, исходя из нумерации в CNP-22, включают K4R, G5S, G5R, G8S, K10R, G15S, S16Q, M17N, G19R и их сочетания.

[0075] В одном из вариантов осуществления пептиды вариантов CNP представляют собой модифицированные пептиды CNP-37 или CNP-38, имеющие мутацию(и)/замену(ы) в сайте расщепления фурина, сконструированные для улучшения устойчивости к протеазе фурин in vivo, и/или содержащие глицин или пролин-глицин на N-конце, сконструированные для улучшения стабильности в плазме и предотвращения образования пироглутамина. Образцовые варианты CNP-37 включают, но не ограничиваясь этим:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N); SEQ ID № 1];

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP-37; SEQ ID № 2);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP-37; SEQ ID № 3);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37 (M32N); SEQ ID № 4];

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP-37; SEQ ID № 5);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP-37; SEQ ID № 6); и

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP-37 или CNP-38: SEQ ID № 7).

C. Синтез и очистка пептидов вариантов CNP

[0076] В некоторых вариантах осуществления пептиды вариантов CNP, которые можно использовать в настоящем описании, получают посредством рекомбинантной экспрессии, используя определенные способы, известные в данной области, в определенных вариантах осуществления. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, тома I и II, ред. D. N. Glover, (1985); и Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

[0077] В определенных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP получают посредством рекомбинантного процесса, который включает культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей первый полинуклеотид, кодирующий пептид варианта CNP, связанный со вторым полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок, в условиях, которые ведут к экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами, где слитый полипептид содержит пептид варианта CNP, непосредственно соединенный с отщепляемым пептидом или белком или опосредованно соединенный с ним через линкер. В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептид варианта CNP, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок. В определенных вариантах осуществления слитый полипептид экспрессируют в виде растворимого белка или в виде тельца включения. Экспрессируемый слитый полипептид можно выделять из клетки-хозяина или среды для культивирования, и выделенный слитый полипептид можно приводить в контакт с расщепляющим средством для того, чтобы высвобождать пептид варианта CNP.

[0078] Способы получения пептидов вариантов CNP описаны в патентах США 8198242, 8377884 и 8598121, включенных в настоящее описание посредством ссылки.

[0079] Клетки-хозяева, используемые для получения пептидов вариантов CNP, могут представлять собой клетки бактерий, дрожжей, насекомых, не млекопитающих позвоночных или млекопитающих. Клетки бактерий включают, без ограничения, клеточные линии и штаммы E. coli. Неограничивающие примеры клеточных линий и штаммов E. coli включают сBL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pGro7, ArcticExpress(DE3), C41 [также называемые C41(DE3)], C43 [также называемые C43(DE3)], Origami B(DE3), Origami B(DE3)pLysS, KRX и Tuner(DE3). В одном из вариантов осуществления пептиды вариантов CNP и слитые белки CNP получают с использованием клеток BL21(DE3). Клетки млекопитающих включают, но не ограничиваясь этим, клетки хомяка, мартышки, шимпанзе, собаки, кошки, коровы, свиньи, мыши, крысы, кролика, овцы и человека. Клетки-хозяева могут представлять собой иммортализованные клетки (клеточную линию) или не иммортализованные (первичные или вторичные) клетки и могут представлять собой клетки любого из широкого спектра типов, такие как, но не ограничиваясь этим, фибробласты, кератиноциты, эпителиальные клетки (например, маммарные эпителиальные клетки, кишечные эпителиальные клетки), клетки яичника (например, клетки яичника китайского хомячка или CHO), клетки эндотелия, глиальные клетки, нервные клетки, форменные элементы крови (например, лимфоциты, клетки костного мозга), хондроциты и другие клетки костного происхождения и предшественники клеток этих соматических типов. Клетки-хозяева, содержащие ДНК или РНК варианта CNP, культивируют в условиях, подходящих для роста клеток, экспрессии ДНК или РНК и идентификации/отбора клеток, экспрессирующих пептид варианта CNP.

[0080] В определенных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP получают рекомбинантной экспрессией в виде слитых белков, содержащих пептид варианта CNP и отщепляемый белок-переносчик или отщепляемую метку (например, пептидную метку), в где слитый белок содержит пептид варианта CNP, непосредственно соединенный с отщепляемым белком-переносчиком или меткой или опосредованно соединенный с ними через линкер. Использование белка-переносчика или метки облегчает, например, обнаружение, выделение и/или очистку слитого белка. Отщепляемые белки-переносчики и метки включают, но не ограничиваясь этим, гистидиновые (например, 6-His) метки; фактор транскрипции человека TAF12 (TAF12), фрагменты TAF12, домен TAF12 с гистоновым фолдом, мутанты TAF12 и их фрагменты, TAF12(C/A), TAF12(D/E), TAF12(4D/4E), TAF12(6D/6E), TAF12(10D/10E), TAF12(C/A & D/E), TAF12(C/A & 4D/4E), TAF12(C/A & 6D/6E), TAF12(C/A & 10D/10E); кетостероидизомеразу (KSI); мальтозусвязывающий белок (MBP); β-галактозидазу (β-Gal); глутатион-S-трансферазу (GST); тиоредоксин (Trx); хитинсвязывающий домен (CBD); BMP-2, мутанты BMP-2, BMP-2(C/A); SUMO; и их мутанты и фрагменты.

[0081] В других вариантах осуществления пептиды вариантов CNP, описанных в настоящем описании, синтезируют с использованием пептидного синтезатора и очищают в соответствии с известными в данной области способами, например, в соответствии со способами Atherton and Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).

D. Способы использования пептидов вариантов CNP, фармацевтические композиции пептидов вариантов CNP и пути введения

Способы использования вариантов CNP

Связанные с костью нарушения/скелетные дисплазии

[0082] Факторы роста фибробластов (FGF) играют важные роли в формировании кости, и мутации в генах рецепторов FGF (FGFR 1, 2 и 3) дают начало различным наследственным скелетным мальформациям (Curr. Biol., 5: 500-507 (1995)). В частности, активирующие мутации в FGFR-3 отвечают за нарушения в длинных костях, включая ахондроплазию, наиболее распространенную форму генетической карликовости человека (Nature, 371: 252-254 (1994); Cell, 78: 335-342 (1994)), более умеренное нарушение гипохондроплазию (Ann. N.Y. Acad. Sci., 785: 182-187 (1996)), и более тяжелую и неонатальную летальную танатофорную дисплазию (TD) I и II типов (Hum. Mol. Genet., 5: 509-512 (1996); Nat. Genet., 9: 321-328 (1995)). Мышиные модели, сверхэкспрессирующие FGF-2 и, следовательно, активирующие FGFR-3, показывают укороченные длинные кости и макроцефалию (Mol. Biol. Cell, 6: 1861-73 (1995)). В соответствии с этой моделью, мыши с дефицитом FGFR-3 демонстрируют заметный чрезмерный рост скелета при более широких пластинках роста (Nature Genet., 12: 390-397 (1996)).

[0083] За счет стимуляции образования матрикса, пролиферации и дифференцировки хондроцитов и увеличения роста длинных костей, пептиды вариантов CNP по раскрытию можно использовать для лечения млекопитающих, в том числе человека, страдающих от связанного с костью нарушения, такого как скелетная дисплазия. Неограничивающие примеры чувствительных к CNP связанных с костью нарушений и скелетных дисплазий включают ахондроплазию, гипохондроплазию, низкий рост, карликовость, остеохондродисплазии, танатофорную дисплазию, врожденный остеогенез, ахондрогенез, врожденную хондродисплазию, гомозиготную ахондроплазию, врожденную хондродисплазию, кампомелическую дисплазию, врожденную летальную гипофосфатазию, врожденный остеогенез перинатального летального типа, синдромы коротких ребер-полидактилии, гипохондроплазию, врожденную хондродисплазию ризомелического типа, метафизарную дисплазию Янсена, врожденную спондилоэпифизарную дисплазию, ателостеогенез, диастрофическую дисплазию, врожденную короткую бедренную кость, мезомелическую дисплазию Лангера, мезомелическую дисплазию Нивергельта, синдром Робинова, синдром Рейнхардта, акродизостоз, периферический дизостоз, дисплазию Книста, фиброхондрогенез, синдром Робертса, акромезомелическую дисплазию, микромелию, синдром Моркио, синдром Книста, метатрофную дисплазию и спондилоэпиметафизарную дисплазию. Кроме того, варианты CNP можно использовать в качестве дополнения или альтернативы для гормона роста для лечения идеопситического низкого роста и других скелетных дисплазий.

[0084] Кроме того, пептиды вариантов CNP можно использовать для лечения других связанных с костью состояний и нарушений, таких как рахит, гипофосфатемический рахит [включая X-сцепленный гипофосфатемический рахит (также называемый рахитом, устойчивым к витамину D) и аутосомный доминантный гипофосфатемический рахит] и остеомаляция [включая индуцированную опухолью остеомаляцию (также называемую онкогенной остеомаляцией или онкогенной гипофосфатемической остеомаляцией)].

[0085] В определенных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP и композиции и составы, содержащие их, по настоящему изобретению можно использовать для улучшения одного или нескольких симптомов или физиологических последствий скелетной дисплазии, где улучшение может представлять собой увеличенный абсолютный рост, увеличенную скорость роста, увеличенную на качественной компьютерной томографии (QCT) минеральную плотность кости, улучшение морфологии пластинки роста, увеличенный рост длинных костей, улучшение морфологии позвоночника, улучшенный объем движений в локтевом суставе и/или сниженное апноэ во сне. В связи с этим, следует отметить, что все термины «улучшенный», «улучшение», «увеличение», «снижение» и их грамматические эквиваленты представляют собой связанные термины, которые при использовании по отношению к симптому или физиологическому последствию состояния заболевания относятся к состоянию симптома или физиологического последствия заболевания после лечения пептидом варианта CNP (или композицией или составом, содержащими его) по настоящему изобретению по сравнению с тем же симптомом или физиологическим последствием заболевания до лечения пептидом варианта CNP (или композицией или составом, содержащими его) по настоящему изобретению (т. е. по сравнению с «базовым уровнем»). Как описано выше, состояние «базового уровня» можно определять или через измерение состояния субъекта до лечения (которое впоследствии можно сравнивать с состоянием у того же субъекта после лечения) или через измерение этого состояния в популяции субъектов, страдающих той же болезнью, которые имеют те же или схожие характеристики (например, возраст, пол и/или состояние или прогрессирование заболевания).

Увеличение или повышение скорости роста

[0086] Композиции и составы по настоящему изобретению также можно вводить с целью повышения или увеличения скорости роста у субъекта, страдающего скелетной дисплазией. В предпочтительном варианте осуществления субъект страдает ахондроплазией.

[0087] Измерения скорости роста у субъектов можно выполнять с течением времени, используя стандартные способы, хорошо известные в данной области. В определенных вариантах осуществления измерения параметров, таких как рост стоя, рост сидя, масса, окружность головы, длина плеча, длина предплечья, длина бедра, длина голени (от колена до ступни), длина кисти (от запястья до конца пальца) и/или длина ступни, можно выполнять в течение точно определенного периода времени для того, чтобы определять конкретную скорость роста, как измеряют посредством какого-либо конкретного параметра. Измерения скорости роста в течение точно определенного периода времени могут быть «годовыми», при которых скорость роста, вычисленную в течение точно определенного периода времени, преобразуют в ожидаемую скорость роста в течение периода в один год. Измерения скорости роста у субъекта перед лечением пептидом варианта CNP по настоящему изобретению (т. е., «базового уровня» скорости роста) можно сравнивать с измерениями скорости роста во время или после лечения пептидом варианта CNP по настоящему изобретению для того, чтобы определять эффект лечения, оказываемый на изменения скорости роста у субъекта. «Базовый уровень» скорости роста также можно определять в популяции субъектов с одним и тем же общим возрастом, полом и состоянием заболевания, как у индивидуума, подлежащего лечению пептидом варианта CNP по настоящему изобретению.

[0088] Улучшения скорости роста, как измеряют посредством оценки одного или нескольких параметров, описанных выше (например, рост стоя и т. д.), индуцированные или обусловленные лечением субъекта, нуждающегося в этом, пептидом варианта CNP по настоящему изобретению (или композицией или составом, содержащими его) можно измерять количественно. В связи с этим, в определенных вариантах осуществления годовое увеличение или улучшение скорости роста по какому-либо конкретному параметру у субъекта, которого лечат вариантом CNP по настоящему изобретению (или композицией или составом, содержащими его), составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50%, или больше от базового уровня. В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, ведут к годовому увеличению скорости роста, как измеряют по росту стоя, по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, или 50% или больше от базового уровня. В других вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, ведут к годовому увеличению скорости роста, как измеряют по росту сидя, массе, окружности головы, длине плеча, длине предплечья, длине бедра, длине голени (от колена до ступни), длине кисти (от запястья до конца пальца) или длине ступни, по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% или больше от базового уровня. Как раскрыто в настоящем описании, сравнение с базовым уровнем может представлять собой годовую скорость роста, как измеряют по конкретному параметру перед лечением того же субъекта пептидом варианта CNP по настоящему изобретению, или может представлять собой скорость роста, определяемую по популяции субъектов с тем же общим возрастом, полом и состоянием заболевания, что и индивидуум, подлежащий лечению пептидом варианта CNP по настоящему изобретению.

[0089] Антропометрические данные, относящиеся к пропорциональности определенных сегментов тела относительно других, также можно получать у субъектов как до, так и после лечения пептидом варианта CNP для того, чтобы определять, ведет ли введение пептида варианта CNP к изменениям в такой пропорциональности. Например, соотношения длины верхней части тела (от талии до верха головы) и длины нижней части тела (от талии до ступни) можно вычислять как до лечения пептидом варианта CNP (т. е., базовый уровень), так и после лечения пептидом варианта CNP для того, чтобы определять, оказывает ли лечение пептидом варианта CNP нежелательный эффект на пропорциональность тела. Соотношения длин плеча и предплечья или бедра и голени (от колена до ступни) также можно вычислять и сравнивать для того, чтобы определять эффект лечения пептидом варианта CNP, оказываемый на пропорциональность тела. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, введение пептида варианта CNP субъекту не ведет к значительному изменению пропорциональности тела, как измеряют по любому конкретному соотношению, по сравнению с базовым уровнем. В связи с этим, в определенных вариантах осуществления лечение пептидом варианта CNP или композицией или составом, содержащими его, по настоящему изобретению ведет к изменению в каком-либо из описанных выше соотношений не больше 0,5, 0,25, 0,20, 0,15, 0,10 или 0,05, предпочтительно не больше 0,05.

[0090] В различных способах, описанных в настоящем описании, предпочтительно введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, не ведет к нежелательному явлению, связанному с исследуемым лекарственным средством степени два или выше или степени три или выше у субъекта, которого лечат. В связи с этим, способы измерения и определения степени физиологических явлений, связанных с лечением субъекта соединением, а также список нежелательных явлений различных степеней можно найти по адресу http://evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5×11.pdf, который включен в настоящее описание посредством ссылки.

[0091] Кроме того, в различных способах, описанных в настоящем описании, предпочтительно введение пептида варианта CNP или композиции или состава, содержащих его, не ведет к клинически значимому изменению (увеличению или снижению по сравнению с базовым уровнем) одного или нескольких из следующих физиологических параметров; концентрация гемоглобина в крови, число тромбоцитов в крови, концентрация электролитов в крови, концентрация азота мочевины в крови, концентрация креатинина в крови, концентрация щелочной фосфатазы в крови, концентрация аланинаминотрансферазы в крови или концентрация аспартатаминотрансферазы в крови. Под «клинически значимым изменением» понимают изменение какого-либо одного или нескольких из вышеуказанных параметров, которые, по наблюдениям, ведут к поддающемуся обнаружению/наблюдаемому нежелательному физиологическому изменению в общем состоянии здоровья субъекта.

Фармацевтические композиции и составы пептидов вариантов CNP

[0092] В дополнительных вариантах осуществления раскрытие предусматривает применение фармацевтических композиций и составов, содержащих пептид варианта CNP и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и/или разбавителей. В определенных вариантах осуществления композиции дополнительно содержат одно или несколько других биологически активных средств (например, ингибиторы протеаз, рецепторных тирозинкиназ и/или клиренс-рецептора NPR-C).

[0093] Неограничивающие примеры эксципиентов, носителей и разбавителей включают носители, жидкости, буферы, регулирующие изотоничность средства, добавки, стабилизаторы, консерванты, солюбилизаторы, поверхностно-активные средства, эмульсификаторы, смачивающие средства, адъюванты и так далее. Композиции могут содержать жидкости (например, воду, этанол); разбавители, содержащие различные буферы (например, Tris-HCl, фосфатные, ацетатные буферы, цитратные буферы), pH и ионную силу детергенты и солюбилизирующие средства (например, полисорбат 20, полисорбат 80); антиоксиданты (например, метионин, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия); консерванты (например, Thimerosol, бензиловый спирт, м-крезол); и объемообразующие вещества (например, лактозу, маннит, сахарозу). Использование эксципиентов, разбавителей и носителей в составе фармацевтических композиций известно в данной области; см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., стр. 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania (1990)), который включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

[0094] Например, носители включают без ограничения разбавители, носители и адъюванты, а также имплантируемые носители и инертные, нетоксичные твердые или жидкие наполнители и инкапсулирующие материалы, которые не вступают в реакцию с активным ингредиентом(ами). Неограничивающие примеры носителей включают фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, воду и эмульсии (например, эмульсии масло/вода). Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.), растительное масло и их смеси.

[0095] В некоторых вариантах осуществления композиции представляют собой жидкие составы. В определенных вариантах осуществления составы содержат пептид варианта CNP в диапазоне концентраций приблизительно от 0,1 мг/мл приблизительно до 20 мг/мл, или приблизительно от 0,5 мг/мл приблизительно до 20 мг/мл, или приблизительно от 1 мг/мл приблизительно до 20 мг/мл, или приблизительно от 0,1 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл, или приблизительно от 0,5 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл, или приблизительно от 1 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл, или приблизительно от 2 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл, или приблизительно 2 мг/мл или приблизительно 10 мг/мл. В других вариантах осуществления состав может представлять собой лиофилизированный состав или может представлять собой жидкий состав, который предварительно восстанавливали из лиофилизированного состава.

[0096] В дополнительных вариантах осуществления композиции содержат буферный раствор или буферное средство для того, чтобы поддерживать pH CNP-содержащего раствора или суспензии в желаемом диапазоне. Неограничивающие примеры буферных растворов включают фосфатно-солевой буфер, Tris-буферный физиологический раствор и буферный физиологический раствор Хэнка. Буферные средства включают, без ограничения, ацетат натрия, фосфат натрия, моногидрат лимонной кислоты и дигидрат цитрата натрия. Также можно использовать смеси буферных средств. В определенных вариантах осуществления буферным средством является уксусная кислота/ацетат или лимонная кислота/цитрат. Количество буферного средства, подходящее для композиции, частично зависит от конкретного используемого буфера и желаемого pH раствора или суспензии. Например, ацетат является более эффективным pH буфером при pH 5, чем при pH 6, так что можно использовать меньше ацетата в растворе при pH 5, чем при pH 6. В некоторых вариантах осуществления буферное средство имеет концентрацию приблизительно 10 мМ±5 мМ. В определенных вариантах осуществления pH композиции составляет приблизительно от pH 3 приблизительно до pH 7,5, или приблизительно от pH 3,5 приблизительно до pH 7, или приблизительно от pH 3,5 приблизительно до pH 6,5, или приблизительно от pH 4 приблизительно до pH 6, или приблизительно от pH 4 приблизительно до pH 5, или составляет приблизительно pH 5,0±1,0, или составляет приблизительно pH 5,5±1,0.

[0097] В других вариантах осуществления композиции содержат регулирующее изотоничность средство для того, чтобы делать раствор или суспензию изотоническими и более совместимыми для инъекции. Неограничивающие примеры регулирующих изотоничность средств включают NaCl, трегалозу, маннит, декстрозу, глюкозу, глицерин, сорбит, ксилит и этанол. В определенных вариантах осуществления регулирующим изотоничность средством является трегалоза или маннит, которые можно использовать индивидуально или в комбинации. В определенных вариантах осуществления трегалоза или маннит присутствует в концентрации приблизительно 160±20 мМ, или приблизительно 140 мМ±20 мМ, или приблизительно 120±20 мМ, или приблизительно 100 мМ±20 мМ, или приблизительно 80 мМ±20 мМ, или приблизительно 60 мМ±20 мМ.

[0098] В различных вариантах осуществления композиции могут содержать консервант. Консерванты включают, но не ограничиваясь этим, м-крезол и бензиловый спирт. В определенных вариантах осуществления консервант присутствует в концентрации приблизительно 0,4%±0,2%, или приблизительно 1%±0,5%, или приблизительно 1,5%±0,5%, или приблизительно 2,0%±0,5%. В определенных вариантах осуществления композиция или состав не содержит консервант.

[0099] В различных вариантах осуществления композиции содержат средство против адсорбции (например, для уменьшения адсорбции варианта CNP на стекле или пластмассе). Средства против адсорбции включают, без ограничения, бензиловый спирт, полисорбат 20 и полисорбат 80. В определенных вариантах осуществления средство против адсорбции присутствует в концентрации приблизительно от 0,001% приблизительно до 0,5%, или приблизительно от 0,01% приблизительно до 0,5%, или приблизительно от 0,1% приблизительно до 1%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 1%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 1,5%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 2%, или приблизительно от 1% приблизительно до 2%.

[0100] В различных вариантах осуществления композиции содержат стабилизатор. Неограничивающие примеры стабилизаторов включают глицерин, глицерин, тиоглицерин, метионин и аскорбиновую кислоту и их соли. В некоторых вариантах осуществления, когда стабилизатором является тиоглицерин или аскорбиновая кислота или их соль, стабилизатор присутствует в концентрации приблизительно от 0,1% приблизительно до 1%.

[0101] В различных вариантах осуществления композиции содержат антиоксидант. Образцовый антиоксидант, без,ограничения представляет собой аскорбиновую кислоту. В определенных вариантах осуществления молярное соотношение антиоксиданта и пептида варианта CNP составляет приблизительно от 0,1:1 приблизительно до 15:1, или приблизительно от 1:1 приблизительно до 15:1, или приблизительно от 0,5:1 приблизительно до 10:1, или приблизительно от 1:1 приблизительно до 10:1 или приблизительно от 3:1 приблизительно до 10:1.

[0102] В композициях можно использовать фармацевтически приемлемые соли, включая, без ограничения, соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат), соли органических кислот (например, ацетат, пропионат, малонат, бензоат, мезилат, тозилат) и соли аминов (например, изопропиламин, триметиламин, дициклогексиламин, диэтаноламин). Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых солей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990)).

[0103] Составы для парентерального введения можно получать, например, в виде жидких растворов или суспензий, в виде твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкой среде перед инъекцией, или в виде эмульсий. Например, стерильные инъецируемые растворы и суспензии можно формулировать в соответствии со способами, известными в данной области, используя подходящие разбавители, носители, растворители (например, буферный водный раствор, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия), диспергирующее средство, смачивающие средства, эмульгирующие средства, суспендирующие средства и т. п. Кроме того, можно использовать стерильные жирные масла, сложные эфиры жирных кислот, полиолы и/или другие неактивные ингредиенты. В качестве дополнительных примеров, составы для парентерального введения включают водные стерильные инъецируемые растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие средства и загустители.

[0104] Образцовые содержащие пептид CNP составы описаны в патентах США 8198242 и 8598121. Предусмотрено использование составов CNP, имеющих pH в диапазоне приблизительно от 4 приблизительно до 6.

[0105] В различных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP можно формулировать в фармацевтических носителях для введения субъектам, пораженным скелетной дисплазией. В некоторых вариантах осуществления жидкие составы пептидов вариантов CNP формулируют в соответствии с любыми комбинациями ингредиентов, и их количества или концентрации описаны далее:

[0106] Композиции, содержащие пептид варианта CNP, также могут представлять собой лиофилизированные составы. В определенных вариантах осуществления лиофилизированные составы содержат буфер и объемообразующее средство и необязательно антиоксидант. Образцовые буферы включают без ограничения ацетатные буферы и цитратные буферы. Образцовые объемообразующие средства включают, без ограничения, маннит, сахарозу, декстран, лактозу, трегалозу и повидон (PVP K24). В определенных вариантах осуществления маннит и/или трегалоза присутствует количестве приблизительно от 3% приблизительно до 10%, или приблизительно от 4% приблизительно до 8%, или приблизительно от 4% приблизительно до 6%. В определенных вариантах осуществления сахароза присутствует количестве приблизительно от 6% приблизительно до 20%, или приблизительно от 6% приблизительно до 15%, или приблизительно от 8% приблизительно до 12%.

[0107] В различных вариантах осуществления лиофилизированные составы пептидов вариантов CNP получают из составов, формулируемых в соответствии с любыми комбинациями ингредиентов, и их количества или концентрации описаны далее:

[0108] В различных вариантах осуществления, состав, содержащий пептид варианта CNP, имеет pH приблизительно 3-7, или приблизительно 3-6, или приблизительно 3,5-6,5, или приблизительно 4-6, или приблизительно 4-5, или приблизительно 4,5-5,5. В некоторых вариантах осуществления для pH 4-5,5 подходящим буферным средством является уксусная кислота/ацетат (например, ацетат натрия), и для pH 5,5-6 подходящим буферным средством является лимонная кислота/цитрат. Лимонная кислота/цитрат (например, цитрат натрия) также является подходящим буферным средством в диапазоне pH 3-6 или pH 4-6. В определенных вариантах осуществления буферное средство в составе имеет концентрацию приблизительно 2-50 мМ, или приблизительно 2-40 мМ, или приблизительно 2-30 мМ, или приблизительно 5-30 мМ, или приблизительно 2-20 мМ, или приблизительно 5-20 мМ, или приблизительно 5-15 мМ.

[0109] Также, чтобы минимизировать или избежать дезамидирования пептида варианта CNP, с помощью лиофилизации можно удалять воду из состава. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированные составы содержат любые комбинации следующих компонентов: буфер: ацетат натрия и уксусная кислота или цитрат натрия и лимонная кислота; изотоническое/объемообразующее средство: маннит (например, 3-10%, 2-8% или 4-6%); сахароза (например, 6-20%, 5-15% или 8-12%); антиоксиданты: метионин и/или аскорбиновая кислота с молярным соотношением каждого антиоксиданта и пептида варианта CNP приблизительно от 0,1:1 приблизительно до 1:1, или приблизительно от 0,5:1 приблизительно до 5:1, или приблизительно от 1:1 приблизительно до 15:1, или приблизительно от 1:1 приблизительно до 10:1, или приблизительно от 3:1 приблизительно до 10:1.

[0110] Дезамидирование также можно минимизировать или избегать посредством хранения композиции CNP (например, жидкого состава или лиофилизированного состава) при пониженной температуре, такой как приблизительно 5°C, 0°C, -10°C, -20°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, -90°C или -100°C.

[0111] Для того чтобы минимизировать или избежать окисления окисляемых остатков (например, метионина) в пептиде варианта CNP, вариант можно формулировать с одним или несколькими антиоксидантами. Образцовые антиоксиданты включают, но не ограничиваясь этим, метионин, аскорбиновую кислоту и тиоглицерин. Окисление, например, остатков метионина также можно минимизировать или предотвращать посредством выдувания кислорода из жидкой среды (в случае жидкого состава) азотом или аргоном и/или посредством выдувания кислорода из контейнера или упаковки азотом или аргоном.

[0112] В некоторых вариантах осуществления, чтобы минимизировать или предотвращать адсорбцию (например, адсорбцию пептида варианта CNP на пластмассе или стекле), в состав CNP добавляют полисорбат 20, полисорбат 80 или бензиловый спирт или их сочетание. В определенных вариантах осуществления каждое из средств против адсорбции присутствует в концентрации приблизительно от 0,001% приблизительно до 0,5%, или приблизительно от 0,01% приблизительно до 0,5%, или приблизительно от 0,1% приблизительно до 1%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 1%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 1,5%, или приблизительно от 0,5% приблизительно до 2%, или приблизительно от 1% приблизительно до 2%. Образцовый диапазон(ы) средства(в) против адсорбции в составе включает, без ограничения, приблизительно от 0,001% приблизительно до 0,5% полисорбата 20, приблизительно от 0,001% приблизительно до 0,5% полисорбата 80 и/или приблизительно от 0,5% приблизительно до 1,5% бензилового спирта.

[0113] Раскрытие также предусматривает наборы, содержащие, например, бутылки, флаконы, ампулы, пробирки, картриджи и/или шприцы, которые содержат жидкий (например, стерильный инъецируемый) состав или твердый (например, лиофилизированный) состав. Наборы также могут содержать фармацевтически приемлемые носители (например, растворители, растворы и/или буферы) для восстановления твердого (например, лиофилизированного) состава в раствор или суспензию для введения (например, посредством инъекции), включая, без ограничения, восстановление лиофилизированного состава в шприце для инъекции, или для разведения концентрата до более низкой концентрации. Кроме того, экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии можно получать, например, из стерильного порошка, гранул или таблеток, содержащих CNP-содержащую композицию. Наборы также могут содержать дозирующие устройства, такие как аэрозольные или инъекционные дозирующие устройства, инъекторы-ручки, автоинъекторы, безыгольные инъекторы, шприцы и/или иглы.

Дозы и частота дозирования

[0114] Как используют в настоящем описании, термин «терапевтически эффективное количество» активного средства (например, пептида варианта CNP) относится к количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект у пациента. Количество может варьировать от одного индивидуума к другому и может зависеть от множества факторов, включая общее физическое состояние пациента. Терапевтически эффективное количество пептида варианта CNP может легко определять специалист в данной области, используя общедоступные материалы и процедуры. Например, количество пептида варианта CNP, используемое для терапии, должно давать приемлемую скорость роста на основании карт физического развития для детей в возрасте от 0 до 17 лет с ахондроплазией (214 женщин и 189 мужчин), в которых перечислены рост для определенного возраста, окружность головы и рост по сегментам (Horton WA et al., Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr., 93: 435-8 (1978)). CDC карты можно использовать для того, чтобы оценивать массу для определенного возраста и массу для определенного возраста или BMI для определенного возраста. Также можно измерять вторичные исходы для курсов, которые являются более хроническими по природе.

[0115] Частота дозирования для конкретного индивидуума может варьировать в зависимости от различных факторов, включая нарушение, которое лечат, и состояние и ответ индивидуума на терапию. В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую пептид варианта CNP, вводят субъекту приблизительно один раз в сутки, один раз в двое суток, один раз в трое суток или один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз каждые две недели или ежемесячно. В одном из вариантов осуществления для лечения связанных с костью нарушений (например, скелетных дисплазий, в том числе ахондроплазии), ежедневно или еженедельно дозу пептида варианта CNP вводят пациентам до и/или на протяжении взрослого состояния.

[0116] В определенных вариантах осуществления пептиды вариантов CNP, описанные в настоящем описании, вводят в дозе в диапазоне приблизительно от 5 или 10 нмоль/кг приблизительно до 300 нмоль/кг или приблизительно от 20 нмоль/кг приблизительно до 200 нмоль/кг. В некоторых вариантах осуществления пептиды вариантов CNP вводят в дозе приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 нмоль/кг или другой дозе, которую лечащий врач сочтет подходящей. В других вариантах осуществления пептиды вариантов CNP вводят в дозе приблизительно 5, 7,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкг/кг или приблизительно 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг/кг, или другой дозе, которую лечащий врач сочтет подходящей. В различных вариантах осуществления пептид варианта CNP вводят в дозе приблизительно от 7,5 до 100 мкг/кг, или приблизительно от 15 до 75 мкг/кг, или приблизительно 15 до 30 мкг/кг, или приблизительно 2,5 мкг/кг, 7,5 мкг/кг, 15,0 мкг/кг, 30,0 мкг/кг или 60,0 мкг/кг. Дозы пептидов вариантов CNP, описанных в настоящем описании, можно вводить в соответствии с частотой дозирования/частотой введения, описанной в настоящем описании, в том числе, без ограничения, ежедневно, 2 или 3 раза в неделю, еженедельно, каждые 2 недели, каждые 3 недели, ежемесячно и т. д. Введение пептида варианта CNP может происходить в течение продолжительного периода времени, в некоторых случаях, в течение одного месяца, трех месяцев, шести месяцев или больше.

[0117] Частота дозирования/введения пептида варианта CNP для конкретного субъекта может варьировать в зависимости от различных факторов, включая нарушение, которое лечат, и состояние и ответ субъекта на терапию. Пептид варианта CNP можно вводить в однократной дозе или в нескольких дозах на дозирование. В определенных вариантах осуществления пептид варианта CNP вводят, в однократной дозе или в нескольких дозах, ежедневно, через сутки, каждые 3 суток, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, еженедельно, раз в 2 недели, каждые 3 недели, ежемесячно, каждые 6 недель, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца или как сочтет подходящим лечащий врач.

[0118] В некоторых вариантах осуществления пептид варианта CNP вводят с тем, чтобы сделать возможными периоды роста (например, хондрогенеза), после чего следует период восстановления (например, остеогенез). Например, пептид варианта CNP можно вводить внутривенно, подкожно, внутрь сустава или другим способом ежедневно или несколько раз в неделю в течение определенного периода времени, после чего следует период без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах осуществления начальный период лечения (например, введения пептида варианта CNP ежедневно или несколько раз в неделю) длится в течение 3 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В связанном варианте осуществления период без лечения длится в течение 3 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. В определенных вариантах осуществления схема дозирования пептида варианта CNP представляет собой ежедневно в течение 3 суток, после чего следует 3 суток отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 1 недели, после чего следует 3 суток или 1 неделя отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 2 недель, после чего следует 1 или 2 недели отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 3 недель после чего следует 1, 2 или 3 недели отмены; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель, после чего следует 1, 2, 3 или 4 недели отмены.

Способы введения

[0119] Пептиды вариантов CNP или фармацевтические композиции или составы, содержащие их, можно вводить субъектам различными способами, например, такими как посредством инъекции подкожно, внутрь сустава, внутривенно, внутриартериально, интраперитонеально, внутримышечно, внутрикожно или интратекально. В одном из вариантов осуществления пептиды вариантов CNP вводят с помощью одной подкожной, внутрисуставной, внутривенной, внутриартериальной, интраперитонеальной, внутримышечной, внутрикожной или интратекальной инъекции один раз в сутки, один раз каждые двое суток, один раз каждые трое суток или один раз в неделю.

[0120] Пептиды вариантов CNP также можно вводить с помощью непосредственной инъекции в или около места заболевания. Кроме того, пептиды вариантов CNP можно вводить посредством имплантации депо в целевом месте приложения действия (например, в области анормального или дегенерированного сустава или хряща). Альтернативно, пептиды вариантов CNP можно вводить сублингвально под язык (например, сублингвальная таблетка) или посредством ингаляции в легкие (например, ингалятор или аэрозольный спрей), посредством доставки в носовую полость (например, интраназальный спрей), посредством доставки в глаз (например, глазные капли) или посредством трансдермальной доставки (например, с помощью пластыря на коже). Пептиды вариантов CNP также можно вводить перорально в форме микросфер, микрокапсул, липосом (незаряженных или заряженных (например, катионных)), полимерных микрочастиц (например, полиамиды, полилактид, полигликолид, поли(лактид-гликолид)), микроэмульсий и т. п.

[0121] Дополнительный способ введения опосредован осмотическим насосом (например, насосом Alzet) или мининасосом (например, миниосмотический насос Alzet), который делает возможной контролируемую, непрерывную доставку и/или доставку с медленным высвобождением для пептида варианта CNP или фармацевтической композиции в течение предварительно определяемого периода. Осмотический насос или мининасос можно имплантировать подкожно, или около целевого места (например, длинных костей конечностей, эпифизов и т. д.).

[0122] Специалисту в данной области очевидно, что пептиды вариантов CNP или их композиции также можно вводить другими способами. Определение наиболее эффективного способа введения пептидов вариантов CNP или их композиций входит в навыки специалиста в данной области

[0123] Дополнительные аспекты и подробности раскрытия видны из следующих примеров, которые предназначены в качестве иллюстрации, но не ограничения.

E. Примеры

Пример 1 - Данные шестимесячного клинического исследования у человека для пациентов с ахондроплазией

[0124] Для того чтобы определять эффект пептидов вариантов CNP, оказываемый на симптомы скелетной дисплазии, такой как ахондроплазия, и на рост длинных костей и/или скорость роста (как измеряют по скорости увеличения роста пациента стоя после лечения по сравнению с тем, что было до лечения) у пациентов с ахондроплазией, исследования с эскалацией дозы осуществляли у детей с ахондроплазией (ACH) в возрасте 5-14 лет (включительно), которые имеют документированную ACH, как документировано на клиническом основании и подтверждено генетическим тестированием.

[0125] До введения состава, содержащего пептид варианта CNP, как раскрыто в настоящем описании, собирали серийные измерения роста (по многим различным параметрам) и измерения отношений скоростей роста (по меньшей мере в росте пациента стоя) с интервалами в три месяца у исследуемых пациентов без лечения, чтобы устанавливать базовые уровни скорости роста и соотношения пропорциональности тела, как описано выше. Когда получали базовые уровни для скорости роста и соотношений пропорциональности тела, после этого вводили состав, содержащий пептид варианта CNP (в частности, Pro-Gly-CNP-37; SEQ ID № 5), в виде суточной дозы подкожно по одной из следующих схем ежедневного дозирования: когорта 1 (n=8): суточная доза пептида Pro-Gly-CNP-37 2,5 мкг/кг, когорта 2 (n=8), суточная доза пептида Pro-Gly-CNP-37 7,5 мкг/кг; когорта 3 (n=10), суточная доза пептида Pro-Gly-CNP-37 15,0 мкг/кг. Подкожное введение осуществляли ежедневно в течение 6 месяцев.

[0126] Более конкретно, пептид Pro-Gly-CNP-37 формулировали в стерильной композиции без консервантов, содержащей 2,0 мг/мл или 10 мг/мл пептида CNP в комбинации с 0,28 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 1,08 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 58,01 мг/мл дигидрата трегалозы, 15 мг/мл D-маннита, 0,73 мг/мл L-метионина и 0,05 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5. Эту жидкую композицию восстанавливали из исходно лиофилизированного состава, содержащего описанные компоненты, и поставляли в стерильном одноразовом необработанном боросиликатном чистом стеклянном сосуде I типа. Этот восстановленный жидкий состав использовали во всех клинических исследованиях лечения у человека, описанных в настоящем описании.

[0127] Во время курса введения пептида варианта CNP выполняли различные оценки, включая массу тела, измерение длины кости и роста кости, в том числе вычисление соотношения длины плеча и длины предплечья, соотношения длины бедра и длины голени и соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела. Измерения скорости роста также вычисляли посредством измерения роста пациентов стоя, и данные сравнивали с базовыми отношениями скоростей роста, полученными предварительно. Оценки выполняли приблизительно в сутки 15, 22, 29, 43, 85, 127 и 183 после первого введения пептида варианта CNP.

[0128] Данные исследовательской оценки визуализацией включали измерения и морфологию позвоночника, длинных костей и конечностей, а также меры для пластинки роста, возраста кости и минеральной плотности кости. Анализы включают переднезадний (AP) рентген таза для оценки базового уровня для бедра; заднепередние (PA) рентгенограммы левой кисти и запястья для того, чтобы оценивать возраст кости (Greulich, 1971, Stanford University Press.); (Tanner, 1975, Academic Press.), пластинки роста, длину кисти и кортикальную толщину; AP рентгенограмму нижней конечности для того, чтобы оценивать пластинки роста, длину большой берцовой кости, кортикальную толщину и кривизну, AP рентгенограммы поясничного отдела позвоночника для того, чтобы оценивать поперечное интерпедикулярное расстояние. Выполняют латеральные рентгенограммы поясничного отдела позвоночника для того, чтобы оценивать угол пояснично-грудного лордоза, морфологию позвонков, а также другие потенциальные изменения, связанные со спинальным стенозом, QCT сканирование предплечья и большой берцовой кости для того, чтобы оценивать минеральную плотность кости, морфологию пластинки роста и длину кости. Это сканирование можно выполнять с использованием стандартного CT сканера, калибровочного фантома и специализированного программного обеспечения, используя предварительно определяемый протокол с низкой дозой облучения, при котором избегают прямого излучения головы и туловища.

[0129] Исследование сна: детское апноэ во сне без лечения повторно связано с плохими функциональными исходами и исходами, касающимися здоровья, включая негативное влияние на определенные аспекты развития детей, такие как поведение и обучение. Сообщалось, что с апноэ во сне у детей связаны когнитивные расстройства, которые включают обучение, память и визуально- пространственные навыки; речь, беглость вербальных навыков, школьную успеваемость и исполнительские функции. Кроме того, педиатрические нарушения дыхания во сне связаны с аномалиями роста; изменениями в здоровье сердечнососудистой системы, включая систолическое и диастолическое кровяное давление, автономную регуляцию, оксигенацию головного мозга и церебральный поток крови, указывают на то, что синдром детского обструктивного апноэ во сне может угрожать долгосрочному здоровью сердечнососудистой системы; и системными маркерами воспаления (Marcus, 2012, Pediatrics). Устройство тестирования во сне используют для того, чтобы оценивать присутствие и тяжесть нарушения дыхания во сне посредством измерения насыщения крови кислородом, частоты пульса и потока воздуха во время мониторинга в течение ночи. Оценка апноэ во сне включает, но не ограничиваясь этим, определение числа эпизодов апноэ и гипопноэ в час (коэффициент апноэ/гипопноэ, AHI).

[0130] Меры объема движений при сгибании-разгибании в локтевом суставе измеряют с использованием гониометра.

[0131] Биологические маркеры оценивают по изменению относительно базового уровня, и это включает, без ограничения, оценку обновления хряща (CTX-II), активности хондроцитов и остеобластов (костная щелочная фосфатаза), формирования кости (P1NP), ремоделирования кости (остеокальцин); и маркеров биологической активности CNP (cGMP, NT-proCNP и ANP), а также дополнительных биологических маркеров. В предусмотренные моменты времени собирают образцы крови и мочи на биохимические маркеры ремоделирования коллагена и кости, а также на маркеры активности CNP.

[0132] Результаты: изменение скорости роста в результате лечения пептидом варианта CNP Pro-Gly-CNP-37 измеряли в когорте 1 (2,5 мкг/кг/сутки), когорте 2 (7,5 мкг/кг/сутки) и когорте 3 (15 мкг/кг/сутки) всего для 26 пациентов посредством измерения изменений роста стоя во время лечения и сравнения с базовым уровнем отношений скоростей роста, измеряемым до лечения. Усредненное изменение скорости роста по росту стоя в исследовании в течение 6 месяцев сведено в таблицу 1. Как продемонстрировано в таблице 1, значительное увеличение скорости роста не наблюдали у пациентов с ахондроплазией, которых лечили с использованием Pro-Gly-CNP-37 2,5 мкг/кг/сутки в течение 6 месяцев (когорта 1). Однако, в отличие от пациентов в когорте 1, пациенты с ахондроплазией, которых лечили с использованием Pro-Gly-CNP-37 7,5 мкг/кг/сутки в течение 6 месяцев (когорта 2), демонстрировали статистически значимое увеличение (p-значение=0,04) скорости роста по росту стоя (по сравнению с их предварительно вычисленным базовым уровнем отношений скоростей роста по росту стоя). Более конкретно, пациенты в когорте 2 демонстрировали среднее увеличение скорости роста по росту стоя 1,3 см/год, которое представляет увеличение годовой скорости роста 45% выше базового уровня. Наконец, пациенты с ахондроплазией, которых лечили с использованием Pro-Gly-CNP-37 15 мкг/кг/сутки в течение 6 месяцев (когорта 3), также демонстрировали статистически значимое увеличение (p-значение=0,01) скорости роста по росту стоя (по сравнению с их предварительно вычисленным базовым уровнем отношений скоростей роста по росту стоя). Более конкретно, пациенты в когорте 3 демонстрировали среднее увеличение скорости роста по росту стоя 2,0 см/год, которое представляет увеличение годовой скорости роста 50% выше базового уровня. Эти данные демонстрируют, что ежедневное подкожное лечение пациентов с ахондроплазией с использованием по меньшей мере 7,5 мкг/кг пептида варианта CNP в течение периода 6 месяцев или дольше оказывает положительный эффект на рост кости, скорость роста и в целом лечение симптомов ахондроплазии.

Таблица 1

[0133] Пропорциональность тела. Соотношения пропорциональности тела (длины верхней части тела и длины нижней части тела, длины плеча и длины предплечья и длины бедра и длины голень [от колена до ступни]) вычисляли для всех пациентов во всех когортах как перед лечением (базовый уровень), так и во время курса лечения пептидом варианта CNP.

[0134] Для когорты 1 средний базовый уровень соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела, средний базовый уровень соотношения длины плеча и длины предплечья и средний базовый уровень соотношения длины бедра и длины голени составлял 2,09, 1,13 и 0,67, соответственно. После 6 месяцев ежедневного подкожного лечения с использованием 2,5 мкг/кг пептида варианта CNP определяли, что те же соотношения пропорций тела составляли 2,07, 1,11 и 0,67, соответственно, что давало средние изменения в тех же соотношениях пропорций тела -0,02, -0,02 и 0,0, соответственно.

[0135] Для когорты 2 средний базовый уровень соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела, средний базовый уровень соотношения длины плеча и длины предплечья и средний базовый уровень соотношения длины бедра и длины голени составлял 2,03, 1,14 и 0,66, соответственно. После 6 месяцев ежедневного подкожного лечения с использованием 7,5 мкг/кг пептида варианта CNP определяли, что те же соотношения пропорций тела составляли 2,03, 1,14 и 0,66, соответственно, что давало средние изменения в тех же соотношениях пропорций тела 0,0, 0,0 и 0,0, соответственно.

[0136] Для когорты 3 средний базовый уровень соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела, средний базовый уровень соотношения длины плеча и длины предплечья и средний базовый уровень соотношения длины бедра и длины голени составлял 1,91, 1,13 и 0,69, соответственно. После 6 месяцев ежедневного подкожного лечения с использованием 15 мкг/кг пептида варианта CNP определяли, что те же соотношения пропорций тела составляли 1,89, 1,08 и 0,69, соответственно, что давало средние изменения в тех же соотношениях пропорций тела -0,02, -0,05 и 0,0, соответственно.

[0137] Эти данные демонстрируют, что лечение пациентов с ахондроплазией пептидом варианта CNP не оказывает значительных нежелательных эффектов на общую пропорциональность тела, поскольку все измеряемые изменения соотношений пропорциональности тела попадали между -0,05 и 0,05, относительно базового уровня, после 6 месяцев лечения пептидом варианта CNP.

[0138] Нежелательные явления. Всех пациентов в каждой из описанных выше когорт регулярно оценивали на присутствие нежелательных явлений (как определено в http://evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5×11.pdf), в частности, обусловленных лечением пептидом варианта CNP. Ни у одного пациента в какой-либо их трех исследованных когорт не доказано нежелательное явление степени два или выше, которое определяли как связанное с исследуемым лекарственным средством, что демонстрирует, что лечение пациентов с ахондроплазией пептидами вариантов CNP не ведет к серьезным нежелательным физиологическим явлениям.

[0139] Кроме того, у всех пациентов в каждой исследованной когорте регулярно осуществляли мониторинг концентрации гемоглобина в крови, числа тромбоцитов в крови, концентрации электролитов в крови, концентрации азота мочевины в крови, концентрации креатинина в крови, концентрации щелочной фосфатазы в крови, концентрации аланинаминотрансферазы в крови и концентрации аспартатаминотрансферазы в крови. Данные, полученные для каждой из трех исследованных когорт, демонстрировали, что не наблюдали клинически значимые изменения какого-либо из описанных выше показателей безопасности, что также подтверждает базовую безопасность терапии ахондроплазии и ассоциированных симптомов пептидом варианта CNP.

Пример 2 - Данные двенадцатимесячного клинического исследования ахондроплазии у человека (когорта 3)

[0140] После периода в первые 6 месяцев лечения и оценки в клиническом исследовании, 10 пациентов с ахондроплазией из когорты 3, описанной выше в примере 1, продолжали клиническую схему 15 мкг/мл Pro-Gly-CNP-37, который вводили подкожно ежедневно в течение дополнительных 6 месяцев (всего 12 месяцев). Во время периода курса дополнительного шестимесячного лечения выполняли различны оценки, включая массу тела, измерение длины кости и роста кости, в том числе вычисление соотношения длины плеча и длины предплечья, соотношения длины бедра и длины голени и соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела. Измерения скорости роста также вычисляли посредством измерения у пациентов роста стоя, и данные сравнивали с базовым уровнем отношений скоростей роста, полученным предварительно.

[0141] Результаты: изменение скорости роста в результате лечения в течение 12 месяцев пептидом варианта CNP Pro-Gly-CNP-37 измеряли в когорте 3 (15 мкг/кг/сутки) суммарно для 10 пациентов посредством измерения изменений роста стоя во время лечения и сравнения с базовым уровнем отношений скоростей роста, измеренным перед лечением. Данные, полученные в этом 12-месячном исследовании, показывали, что пациенты с ахондроплазией, которых лечили с использованием 15 мкг/кг/сутки Pro-Gly-CNP-37 в течение 12 месяцев (когорта 3), демонстрировали статистически значимое увеличение (p-значение=0,017) скорости роста по росту стоя (по сравнению с их предварительно вычисленным базовым уровнем отношения скоростей роста по росту стоя). Более конкретно, пациенты в когорте 3 демонстрировали среднее увеличение скорости роста по росту стоя 1,9 см/год, что давало увеличение годовой скорости роста больше чем 47% выше базового уровня. Эти данные демонстрируют, что ежедневное подкожное лечение пациентов с ахондроплазией с использованием по меньшей мере 15 мкг/кг пептида варианта CNP в течение периода 12 месяцев или более оказывает положительный эффект на рост кости, скорость роста и в целом лечение симптомов ахондроплазии.

[0142] Пропорциональность тела. Соотношения пропорциональности тела (длины верхней части тела и длины нижней части тела, длины плеча и длины предплечья и длины бедра и длины голени [от колена до ступни]) вычисляли для 10 пациентов в когорте 3 как перед лечением (базовый уровень), так и во время курса лечения пептидом варианта CNP.

[0143] Для когорты 3 средний базовый уровень соотношения длины верхней части тела и длины нижней части тела, средний базовый уровень соотношения длины плеча и длины предплечья и средний базовый уровень соотношения длины бедра и длины голени составлял 1,91, 1,13 и 0,69, соответственно. После 6 месяцев ежедневного подкожного лечения с использованием 15 мкг/кг пептида варианта CNP определяли те же соотношения пропорций тела, которые составляли 1,88, 1,16 и 0,69, соответственно, что давало средние изменения в тех же соотношениях пропорций тела -0,03, 0,03 и 0,0, соответственно.

[0144] Эти данные демонстрируют, что лечение пациентов с ахондроплазией пептидом варианта CNP не оказывает значительного нежелательного эффекта на общую пропорциональность тела, поскольку все измеренные изменения соотношений пропорциональности тела попадали между -0,05 и 0,05, относительно базового уровня, после 12 месяцев лечения пептидом варианта CNP.

[0145] Нежелательные явления. Всех пациентов в когорте 3 регулярно оценивали на присутствие нежелательных явлений (как определено в http://evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5×11.pdf), в частности, обусловленных лечением пептидом варианта CNP во время курса лечения. Ни у одного пациента в когорте 3 не доказано нежелательное явление степени два или выше, которое определяли как связанное с исследуемым лекарственным средством, что демонстрирует, что лечение пациентов с ахондроплазией пептидами вариантов CNP не ведет к серьезным нежелательным физиологическим явлениям.

[0146] Кроме того, у всех пациентов в когорте 3 регулярно осуществляли мониторинг концентрации гемоглобина в крови, числа тромбоцитов в крови, концентрации электролитов в крови, концентрации азота мочевины в крови, концентрации креатинина в крови, концентрации щелочной фосфатазы в крови, концентрации аланинаминотрансферазы в крови и концентрации аспартатаминотрансферазы в крови. Данные, полученные в этом исследовании, демонстрировали, что не наблюдали клинически значимых изменений в каком-либо из описанных выше показателей безопасности, что также подтверждает базовую безопасность терапии ахондроплазии и ассоциированных симптомов пептидом варианта CNP.

[0147] На основе клинических данных человека, описанных выше, ежедневное подкожное введение доз Pro-Gly-CNP-37 30 мкг/кг/сутки и 60 мкг/кг/сутки пациентам-людям с ахондроплазией также следует тестировать на эффект и безопасность, как описано выше. На основе данных, раскрытых в настоящем описании, полностью обоснованно предполагают, что такие схемы введения обеспечат как эффективность, так и безопасность лечения ахондроплазии у пациентов-людей.

[0148] Как ожидают, специалистам в данной области будут понятны многие модификации и вариации раскрытия, как изложено в вариантах осуществления и иллюстративных примерах, описанных в настоящем описании. Следовательно, на раскрытие следует накладывать только такие ограничения, как приведены в приложенной формуле изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.

<120> ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВАРИАНТОВ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА C-ТИПА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

СКЕЛЕТНОЙ ДИСПЛАЗИИ

<130> 30610/49788

<150> US-62/199,081

<151> 2015-07-30

<150> US-62/320,704

<151> 2016-04-11

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly

1 5 10 15

Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 2

<211> 38

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 3

<211> 38

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Pro Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 4

<211> 38

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 5

<211> 39

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly

20 25 30

Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 6

<211> 39

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly

20 25 30

Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 7

<211> 38

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<---