Результат интеллектуальной деятельности: Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.

Известно использование тест-системы при проведении ПЦР в реальном времени для определения ДНК тканей животных в мясном продукте (CN 108624659 A, кл C12G 1/6851, 2018 г.).

Также известно техническое решение, содержащее набор идентификации ДНК животных, входящих группу: мышь, крыса, собака, кошка и др. в кормах и мясных продуктах (патент РФ №2560579, C12Q 1/68, 2015 г.), включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец и другие контрольные образцы.

Однако, известный набор используется для полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией, в которой нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности ткани животного в кормах и мясных продуктах.

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.), включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

взятых в объемном соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК ткани медведя в кормах и пищевых продуктах, недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага в качестве внутреннего контрольного образца, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты, а также использование в положительном контрольном образце генома бактериофага Т4 с возможными повреждениями, после исследования, что также влияет на точность выявления объекта.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности, упрощение процесса подготовки внутреннего контрольного образца и уменьшение стоимости этого процесса.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для идентификации ДНК ткани медведей (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани медведя (Ursus) со следующей нуклеотидной последовательностью:

Новизна заявляемой тест-системы состоит в том, что идентификация видовой принадлежности тканей медведя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-ситема идентификации ДНК ткани медведей (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах реализуется следующим образом.

Для исследования сухих кормов и мясных полуфабрикатов на содержание ДНК ткани медведя проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани медведя (Ursus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации ткани медведя для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов ДНК ткани медведей (Ursus) и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани медведей в продуктах. Использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также улучшает качество процесса идентификации

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для ДНК медведей (Ursus) были отобраны на основе гена 12S РНК (Ursus arctos 12S ribosomal RNA gene, partial sequence; and tRNA-Val gene, complete sequence; mitochondrial, код доступа AYO12153.1 complete genome, участок между 500 и 700). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидные флуоресцентно-меченный зонд Ursus Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ursus F и Ursus R) Зонд был помечен красителем FAM. Подобранные нуклеотидные последовательности:

Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах каких либо животных (не включая представителей рода Ursus) и любых видов растений, которые потенциально могут быть использованы при производстве кормов и пищевых продуктов.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного использования тест-системы для идентификации тканей медведя

Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-МЕДВЕДЬ-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-МЕДВЕДЬ-ФАКТОР» для определения ДНК ткани медведей (Ursus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-163-51062356-2018, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.

Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Исследования состоит из трех этапов:

• экстракция нуклеиновая кислота (НК);

• проведение реакции ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани медведей, в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл.

Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) МЕДВЕДЬ, ВКО МЕДВЕДЬ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани медведей и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ МЕДВЕДЬ;

10 мкл ПЦР БУФЕР МЕДВЕДЬ;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки ам-плификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Интерпретация результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК - на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К - на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.

В образце обнаружена ДНК ткани медведей (Ursus), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.

Образец считается отрицательным ДНК (Ursus) не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания тканей медведей представлен в таблице 5.

Для доказательства эффективности использования ГГЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ГГЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном на-тивного бактериофага. Оказалось чувствительность ГГЦР при обнаружении примеси ткани медведей в кормах и в мясных фаршах примерно в 1,5 раза выше. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани медведей в кормах и фаршах снизилась на 3-5%.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».

<120> Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

<140> 2019133139

<160> 6

<210> 1

< 211> 20

< 212> ДНК

< 213> Ursus

< 400> 1

cccgatagacctcaccacct 20

<210> 2

< 211> 20

< 212> ДНК

< 213> Ursus

< 400> 2

caccccatgggttacacctt 20

<210> 3

< 211> 24

< 212> ДНК

< 213> Ursus

< 400> 3

cttgttccttttaagggtttgctg 24

<210> 4

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 4

tacatataaatcacgcaaagc 21

<210> 5

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 5

tagtatggctaatcttattgg 21

<210> 6

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 6

acattggcactgaccgagttc 21

<---