Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Т-7817, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов

Штамм бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-7817, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-7817, обладающий высокой ростовой активностью и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.

Производство ферментированных продуктов питания основано на использовании стартовых культур. Например, для производства продуктов молочнокислого брожения применяют стартовые культуры молочнокислых бактерий. Разрабатываются новые стартовые культуры молочнокислых бактерий с промышленно важными свойствами, обладающие органолептическими, технологическими, питательными и/или медицинскими преимуществами. Примерами являются молочнокислые бактерии, которые продуцируют полисахариды, ароматические соединения, витамины и противомикробные вещества.

Качество и биологическая ценность кисломолочных продуктов напрямую зависят от применяемых стартовых культур. Культуры должны обеспечивать воспроизводилось технологического процесса, стабильное качество готовой продукции, кроме того, культуры должны быть устойчивы к бактериофагам, иметь высокую выживаемость при хранении, обеспечивать ферментируемый молочный продукт необходимыми свойствами, а также позволять проявлять больше гибкости на производстве (использовать разные штаммы с разными свойствами и возможность комбинировать их в зависимости от качества сырья).

Основными компаниями-правообладателями в исследуемой области являются Chr. Hansen (Дания), Bright Dairy & Food Co. (Китай), Meiji Holdings Co (Япония), DuPont Nutrition & Biosciences (Дания), Gervais Danone (Франция), NESTEC (Швейцария).

Данные компании в составе заквасок прямого внесения в большинстве случаев используют мутированные штаммы болгарской палочки с целью устранения эффекта «вторичного скисания» (патент US20020081712), а также увеличения срока годности и температуры хранения кисломолочного продукта до 20-25°С (патент WO 2017194650). В патенте RU 2446209 описан штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, который был подвергнут химическому мутагенезу.

Использование мутированных штаммов как компонентов заквасок прямого внесения имеет определенные недостатки. Неспецифический мутагенез ведет как к приобретению штаммом необходимого свойства, так и к появлению неспецифических мутаций, что приводит к нестабильности генома и быстрому вырождению данного штамма, что сильно ограничивает число генераций (пересевов) штамма, при которых он сохраняет свои технологические свойства.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Т-7817, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве закваски прямого внесения.

Задачей изобретения является получение нового штамма, не являющегося генетически модифицированной культурой, обеспечивающего стабильное получение кисломолочных продуктов питания, а также обладающего высокой эффективностью в процессе получения сухой лиофилизированной микробной массы для изготовления заквасок прямого внесения.

Задача изобретения решается посредством селекции нового штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Т-7817 (регистрационный номер ГКНМ №1264), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных и лечебно-диетических продуктов питания, и обладающего высокой ферментативной активностью.

Технический результат заключается в том, что предлагаемый к использованию штамм обладает быстрым набором биомассы при культивировании и укороченной лаг-фазой при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида, а кисломолочные продукты на его основе обладают низкой кислотностью (80-100°Т), которая сохраняется на протяжении 14 суток хранения, а также плотным сгустком. При хранении кисломолочных продуктов с использованием данного штамма не образуется сыворотка.

Предлагаемый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-7817 новый, в научной и патентной литературе не описан.

Штамм выделен из домашнего кисломолочного продукта. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-7817 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1264.

1. Анатомо-морфологические свойства штамма.

Изучение колоний в полужидкой среде проводили на протяжении 12 пересевов суточных культур в среде «Бифидум сухой» производства ГНЦ ПМ п. Оболенск, далее (БС). В полужидкой БС питательной среде форма единичных колоний - шарик - шарик с хвостиком, диаметром до 3-х мм, рост наблюдали по всему объему среды, кроме зоны аэробиоза (до 0,5 см), а на поверхности плотной питательной среды (агаризованной среды БС) в анаэробных условиях вырастают полупрозрачные непигментированные шероховатые колонии (R-форма), мягкой консистенции. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, прямые или слегка изогнутые крупные палочки с закругленными концами, иногда образующие короткие цепочки.

2. Технологические свойства штамма.

Для определения особенностей штамма проводили культивирование при максимальной температуре 50°С. (Оптимальная температура развития для штамма 40-45°С, максимальная 45-50°С).

Наблюдали выраженный рост по всей толще среды без зоны аэробиоза, в полужидкой БС среде при высоких температурах. Данная культура растет в толще полужидких питательных сред и очень слабо (легкий налет) на поверхности плотных сред в присутствии кислорода, т.е. штамм относится к анаэробам.

3. Протеолитическая активность культуры.

Для изучения протеолитических свойств изменение величины титруемой кислотности при росте в молоке проводили на стерильном 9% восстановленном сухом обезжиренном молоке, приготовленном на участке питательных сред ОИР ООО «Агробиопрод». (Молоко сухое обезжиренное, сорт стандарт, СТБ 1858-2009, республика Беларусь).

Кислотность кисломолочных продуктов определяли в условных единицах-градусах Тернера (°Т) (ГОСТ 3624-67).

Ход определения: в колбу или стакан на 100-150 мл отмеряют пипеткой 10 г исследуемого продукта. В стакан вносят 20 мл дистиллированной воды, добавляют 3 капли 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 Н раствором NaOH до достижения величиной рН значения 8,5±0,05 ед. и появления бледно-розового цвета, не исчезающего в течение 1 минуты. Количество щелочи, израсходованное на титрование, умножают на 10. Штамм к 16 часам сквашивает молоко с образованием равномерного сметанообразного сгустка приятного вкуса без синерезиса. В 1 мл сквашенного стерильного молока к 12 часам культивирования накапливается до 108 микробных клеток. Каталазу не образует. Данные накопления титруемой кислотности представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемый штамм лактобацилл проявляет стабильные протеолитические свойства.

5.Ферментативная активность культуры.

По результатам изучения ферментативных свойств штамма лактобацилл с применением двух тест-систем было обнаружено, что заявляемый штамм ферментирует глюкозу, маннозу, лактозу, сахарозу.

Оптимальная температура культивирования 42±1°С. В качестве сред для культивирования штамма использовали обезжиренное молоко, среду Блаурокка, ГМ-среду, МРС-2, МРС-4 и другие.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев.

Генетическая идентификация штамма подтверждена с помощью анализа 16SpPHK.

В качестве прототипа использовали штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ВКПМ B-3141, депонированный во Всеросийской коллекекции промышленных микроорганизмов.

Регидратированные лиофилизаты каждого штамма в объеме 1,0% вносили в восстановленное сухое молоко. При этом наблюдаемый период лаг-фазы у заявляемого штамма был значительно короче (2,5 часа), чем у штамма-прототипа (5-5,5 часов), что является важным условием для промышленного производства кисломолочной продукции.

Аналогичным образом изучали скорость накопления биомассы у заявляемого штамма и штамма-прототипа, которая также показала, что изменение оптической плотности жидкой культуры заявляемого штамма через 12 часов культивирования в питательной среде на основе СОМ достигало 14,3 ед., в то время как у штамма-аналога оно составляло 9 ед., т.е. было примерно на 50% выше.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для приготовления производственной закваски прямого внесения на первом этапе получали посевной материал для засева в ферментер, для этого ресуспендировали флакон лиофилизированной культуры штамма, а полученную суспензию вносили в среду Блаурокка и инкубировали при температуре 37°С 18-24 часа. Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для получения культуры 2-ой генерации. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации: 12-18 ч.

Для получения жидкой биомассы посевной материал 2-ой генерации вносили в биореактор в количестве 5% от объема среды культивирования. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации до 5-6 ч.

Для получения сухой лиофилизированной микробной массы жидкую биомассу концентрировали методом центрифугирования, смешивали со средой высушивания на основе сахарозы и желатины и проводили лиофильное высушивание.

Полученный лиофилизат может быть использован в качестве закваски, как в виде монокультуры, так и как компонент комплексной закваски для производства кисломолочной продукции.

Пример 2. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления йогурта. Для приготовления йогурта использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T7817 в количестве 0,03% вместе с лиофилизатом штамма Streptococcus thermophillus Т-5367 (Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1266). Штамм Streptococcus thermophillus Т-5367 вносили в количестве 0,05%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали до 6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,7±0,1. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Образующийся сгусток - белый, не тянущийся, без признаков синерезиса. Вкус - кисломолочный, йогуртный, слабокислый, инертный. Величина рН йогурта на 14 суток хранения составила 4,2 ед., титруемая кислотность - 87°Т, титр КОЕ 3,6 × 10⁸ КОЕ/г.Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.

Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе поликомпонентной закваски прямого внесения.