Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809, обладающий высокой ростовой активностью и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.

Обеспечение продуктами питания, имеющими высокую биологическую ценность и способными оказывать лечебно-профилактическое действие, выполняющими роль продуктов функционального питания, является важным аспектом пищевой промышленности. Особое место среди продуктов функционального питания занимают кисломолочные продукты.

Производство ферментированных продуктов питания основано на использовании стартовых культур. Например, для производства продуктов молочнокислого брожения применяют стартовые культуры молочнокислых бактерий. В последнее время разрабатываются новые стартовые культуры молочнокислых бактерий с промышленно важными свойствами: обеспечение микробиологической безопасности и органолептические, технологические, питательные и/или медицинские преимущества. Примерами являются молочнокислые бактерии, которые продуцируют противомикробные вещества, полисахариды, ароматические соединения, витамины, полезные ферменты и обладают пробиотическими свойствами.

Качество и биологическая ценность кисломолочных продуктов напрямую зависят от применяемых стартовых культур. Культуры должны обеспечивать воспроизводимость технологического процесса, стабильное качество готовой продукции, кроме того, культуры должны быть устойчивы к бактериофагам, иметь высокую выживаемость, обеспечивать ферментируемый молочный продукт необходимыми свойствами, а также позволять проявлять больше гибкости на производстве (использовать разные штаммы с разными свойствами и/или комбинировать их в зависимости от качества сырья).

Для удовлетворения данных требований применяют закваски прямого внесения (Direct Vat Set (DVS) / Direct Vat Inoculation (DVI)), которые производятся в виде замороженных гранул или в лиофилизированной форме. Для обеспечения высокого качества заквасок прямого внесения, штаммы культур должны обладать высокой выживаемостью в процессе изготовления заквасок прямого внесения.Основными компаниями-правообладателями в исследуемой области являются Chr. Hansen (Дания), Bright Dairy & Food Co. (Китай), Meiji Holdings Co (Япония), DuPont Nutrition & Biosciences (Дания), Gervais Danone (Франция), NESTEC (Швейцария).

За рубежом в составе заквасок прямого внесения часто используют мутированные штаммы болгарской палочки с целью устранения эффекта «вторичного скисания» в результате ферментации лактозы (патент РФ №2232816, патент РФ №2446209).

Использование мутированных штаммов как компонентов заквасок прямого внесения имеет некоторые недостатки: неспецифический мутагенез ведет как к приобретению штаммом необходимого свойства, так и к появлению неспецифических мутаций, что приводит к нестабильности генома и постепенному вырождению данного штамма, что, в свою очередь, сильно ограничивает время его применения.

Задачей изобретения является получение нового штамма, не являющегося генетически модифицированной культурой, обеспечивающего получение кисломолочных продуктов питания, а также обладающего высокой эффективностью в процессе получения сухой лиофилизированной микробной массы для изготовления заквасок прямого внесения.

Задача изобретения решается посредством селекции нового штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 (регистрационный номер ГКНМ №1262), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных продуктов, и обладающего высокой биохимической активностью.

Настоящее изобретение относится к культуре штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве компонента комплексной закваски прямого внесения для производства кисломолочных лечебно-профилактических продуктов питания.

Технический результат заключается в том, что предлагаемый к использованию штамм обладает быстрым набором биомассы при культивировании, высокой антагонистической активностью и укороченной лаг-фазой при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида, а кисломолочные продукты на его основе обладают низкой кислотностью (80-100°Т), которая сохраняется на протяжении 3 суток хранения, а также плотным сгустком. При хранении кисломолочных продуктов с использованием данного штамма не образуется сыворотка.

Предлагаемый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 новый, в научной и патентной литературе не описан.

Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 выделен из домашнего кисломолочного продукта. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1262.

1. Изучение анатомо-морфологических свойств штамма.

Изучение колоний в полужидкой среде проводили на протяжении 12 пересевов суточных культур. В полужидкой БС питательной среде форма единичных колоний - рыхлая комета-елочка, длиной 5-7 мм, растет по всему объему среды, включая зону аэробиоза, на поверхности плотной питательной среды вырастают прозрачные апигментированные шероховатые колонии (R-форма), сметаноподобной консистенции. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, прямые длинные тонкие палочки с закругленными концами, образующие цепочки из 4-8 клеток.

2. Идентификация изучаемого штамма.

Для идентификации изучаемого штамма по белкам клеточной стенки использовали Bruker Daltonik MALDI Biotyper. Для этого брали единичные колонии 24 часовых культур третьей генерации, выращенных на поверхности МРС-4 в анаэробных условиях

По данным MALDI штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 определен как Lactobacillus delbrueckii с высокой долей достоверности (Score 2,433).

Генетическая идентификация штамма также подтверждена с помощью анализа 16SpPHK.

3. Изучение технологических свойств штамма.

Для определения особенностей штамма проводили культивирование при максимальной температуре 50°С.(Оптимальная температура развития для штамма 40-45°С, максимальная 45-50°С).

Наблюдали выраженный рост по всей толще среды, включая зону аэробиоза, - в полужидкой БС среде при высоких температурах. Данная культура растет в толще полужидких питательных сред и на поверхности плотных сред в присутствии кислорода, т.е. штамм относится к аэротолерантным микроорганизмам (микроаэрофилам).

4. Изучение протеолитической активности культуры. Изучение протеолитических свойств, накопление титруемой кислотности в молоке проводили на стерильном 12% сухом обезжиренном молоке, приготовленном в лаборатории питательных сред ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. (СОМ по ГОСТ 33629-2015 "КОНСЕРВЫ МОЛОЧНЫЕ. МОЛОКО СУХОЕ. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ", поставщик -Агропромышленный Союз «Алев»).

Кислотность кисломолочных продуктов определяли в условных единицах - градусах Тернера (Т) (ГОСТ 3624-67).

Ход определения: В колбу или стакан на 100-150 мл отмеряют пипеткой 10 мл исследуемого продукта. Остатки продукта на стенках пипетки смывают 20 мл дистиллированной воды, добавляют 3 капли 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 Н раствором NaOH до появления бледно-розового цвета, не исчезающего в течение 1 минуты. Количество щелочи, израсходованное на титрование, умножают на 10 в пересчете на 100 мл продукта.

Штамм к 16 часам сквашивает молоко с образованием равномерного сметанообразного сгустка приятного вкуса без синерезиса. В 1 мл сквашенного стерильного молока к 12 часам культивирования накапливается 10⁸ микробных клеток. Каталазу не образует. Данные накопления титруемой кислотности представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемый штамм лактобацилл проявляет стабильные протеолитические свойства.

5. Изучение антибиотикочувствительности штамма.

Чувствительность к антибиотикам штамма изучали на модели 15 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско - диффузионным методом в интерпретации Назыровой Н.Р. с соавт., 2008 г., рекомендованной МУ 2.3.2.2789-10. В работе использованы диски производства HiMedia для определения чувствительности к антимикробным препаратам. Полученные данные представлены в таблице 2.

* антибиотики, содержание которых контролируется в продуктах питания, наиболее важные для контроля за распространением антибиотикорезистентности.

Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 чувствителен к стрептомицину, ампициллину, цефалотину, гентамицину, линкомицину, полимиксину, пенициллину-G, тетрациклину, эритромицину, налидиксовой кислоте, ванкомицину, имипенему, промежуточно-устойчив к канамицину, устойчив к хлорамфениколу (левомицетину) и ципрофлоксацину.

6. Изучение ферментативной активности штамма

При изучении ферментативных свойств штамма сравнивали данные двух тест-систем API-50 CHL и АНАЭРОТЕСТ - 23. По результатам изучения ферментативных свойств штамма лактобацилл с применением двух тест-систем было обнаружено, что заявляемый штамм ферментирует глюкозу, фруктозу, лактозу, мочевину, замедленно ферментирует рамнозу, целлобиозу, ксилозу, D-арабинозу.

Оптимальная температура культивирования 40-45°С. В качестве сред для культивирования штамма использовали обезжиренное молоко, среду Блаурокка, ГМ -среду, МРС, МРС-2, МРС-4 и другие. Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев.

Штамм не является генетически модифицированным, относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах СП 1.3.2322-08 и СП 1.3.2518-09. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

7. Изучение антагонистической активности штамма.

Изучение антагонистической активности штамма проводили согласно МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. В качестве штамма-прототипа использовался штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ВКПМ В 3141, депонированный во Всеросийской коллекекции промышленных микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что заявляемый штамм проявляет более высокую антагонистическую активность в отношении основных патогенных микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления.

Для подтверждения высокой активности сквашивания заявляемого штамма по сравнению со штаммом-прототипом, в качестве которого использовали штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ВКПМ B-3141, депонированный во Всеросийской коллекции промышленных микроорганизмов, лиофилизаты каждого штамма в объеме 0,1% вносили в восстановленное сухое молоко. При этом наблюдаемый период лаг-фазы у заявляемого штамма был значительно короче (1,5 часа), чем у штамма-прототипа (4,5-5 часов), что является важным условием для промышленного производства кисломолочной продукции.

Аналогичным образом изучали скорость накопления биомассы у заявляемого штамма и штамма-прототипа, которая также показала, что оптическая плотность роста культуры заявляемого штамма через 12 часов культивирования в питательной среде на основе СОМ достигала 18 OD, в то время как у штамма-прототипа она составляла 9 OD., т.е. была выше в два раза.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления производственной закваски прямого внесения на первом этапе получали посевной материал для засева в ферментер, для этого ресуспендировали флакон лиофилизированной культуры штамма, а полученную суспензию вносили в среду Блаурокка и инкубировали при температуре 37°С 18-24 часа.

Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для получения культуры 2-ой генерации. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации: 12-18 ч.

Для получения жидкой биомассы посевной материал 2-ой генерации вносили в биореактор в количестве 5% от объема среды культивирования. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации до 12 ч.

Для получения сухой лиофилизированной микробной массы жидкую биомассу концентрировали методом центрифугирования, смешивали со средой высушивания на основе сахарозы и желатины и проводили лиофильное высушивание.

Полученный лиофилизат может быть использован в качестве компонента комплексной закваски прямого внесения для производства кисломолочной продукции.

Пример 2. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления йогурта.

Для приготовления йогурта использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus T-4809 в количестве 0,1% вместе с лиофилизатом штамма Streptococcus thermophillus Т-5367 (депонирован в ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под коллекционным номером 1266) также в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,5. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.

Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в качестве компонента закваски прямого внесения.