Способ конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа высушивания конвективным методом биологических материалов, находящихся в высокодисперсном состоянии и содержащих бактерии, вирусы, иммуноглобулины и другие действующие вещества биологической природы.

Известен способ сушки биологических материалов, в соответствии с которым обезвоживание осуществляют в два этапа: на первом этапе частичное обезвоживание материала осуществляют за счет смешивания его с безводной лактозой, при этом лактоза превращается в кристаллогидрат, что в последующем облегчает процесс удаления влаги до требуемой остаточной влажности материала (от 2 до 4%); на втором этапе производят досушивание материала вакуумным испарением влаги при разрежении, исключающем самозамораживание, при подогреве не выше 25°С (1).

Основным недостатком известного аналога является невозможность его использования для обезвоживания высокодисперсных материалов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения сухих бактериальных препаратов, в соответствии с которым суспензию микроорганизмов смешивают с сорбентом - сухим высокодисперсным порошком диоксида кремния, в соотношении 2:1, сушку ведут в термостате при 27-32°С или на воздухе и полученную смесь диспергируют до тонкодисперсного состояния (2).

По сути известный способ предполагает комбинированное обезвоживание суспензии микроорганизмов: на первом этапе удаление части влаги сорбентом - порошком диоксида кремния, на втором - удаление оставшейся влаги из материала (и сорбента) в термостате при 27-32°С или на воздухе.

Основными недостатками прототипа являются большая инактивация действующих веществ биологической природы в процессе обезвоживания биоматериалов и их хранения и невозможность получения сухих материалов с высокой дисперсностью. Кроме того, способ не учитывает влияние относительной влажности на результат процесса высушивания.

Общим признаком заявляемого изобретения и прототипа является удаление влаги при атмосферном давлении (на воздухе) за счет конвективного подвода тепла к высушиваемому материалу из окружающей среды.

Технической проблемой, решаемой при создании изобретения, является разработка способа конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов, содержащих действующие вещества биологической природы, позволяющего снизить инактивацию действующих веществ в процессе высушивания и последующего хранения, а также повысить концентрацию действующих веществ в материале.

Техническим результатом заявляемого изобретения является тот факт, что заявленный конвективный способ высушивания по сравнению с прототипом, позволяет снизить инактивацию действующих веществ биологической природы в процессе высушивания на 16-40%, в процессе хранения сухих материалов на 13-42%, а высокодисперсные биоматериалы, полученные при реализации заявленного способа, обладают в 1,5-9,4 раз большей концентрацией действующих веществ по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом.

Сущность изобретения заключается в том, что содержащие действующие вещества биологической природы в жидкой фазе высокодисперсные биоматериалы обезвоживают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%.

Стабилизация микрокапельного состояния жидкой фазы в препарате достигается при соотношении жидкой фазы и сухого высокодисперсного гидрофобного аэросила от 10:1,5 до 10:6 (3).

Известно, что каплю жидкости в воздухе сжимает лапласовское давление, величина которого возрастает с уменьшением размера капли. Движущей силой процесса обезвоживания капли является разница в давлении пара над поверхностью капли и в окружающем ее газе (воздухе), и чем меньше размер капли, тем выше скорость ее испарения. Схожесть состояния жидкости в аэрозоле и в микрокапельном порошке обусловливает возможность эффективного атмосферного обезвоживания порошка. Однако, в этом случае на биологические компоненты в порошке, как и в аэрозоле, помимо собственно обезвоживания будут оказывать влияние различные действующие факторы, к наиболее существенным из которых следует отнести температуру и относительную влажность окружающего воздуха.

Данные литературы о зависимости инактивации биокомпонентов в аэрозоле от относительной влажности воздуха противоречивы. Так, температура 12-15°С и относительная влажность 50-90% наиболее благоприятны для выживания пастерелл в воздухе (4). Влодавец В.В. обнаружил чрезвычайно быстрое отмирание Е. coli и S. marcescens в аэрозолях при низких показателях относительной влажности (5). Самая высокая выживаемость этих бактерий отмечена при температуре 18,5-21°С и относительной влажности воздуха выше 70%. Он же отмечает, что Staph. albus и Sarcina lutea, адаптированные к условиям внешней среды, хорошо сохраняются в аэрозоле при относительной влажности от 12 до 90% и температуре 18,5-21°С.

Songler J.R. (6), изучая выживаемость при температуре воздуха 23°С некоторых инфекционных агентов, пришел к выводу, что вирус ринотрахеита крупного рогатого скота и бактериофаг Е. coli ВТ₃ более устойчивы при относительной влажности 90%, чем при влажности воздуха 10 и 35%, тогда как вирусы болезни Ньюкасла и везикулярного стоматита выживали лучше при относительной влажности более 10%. Изучая выживаемость в аэрозоле вирусов группы Колумбия-SK и Менго-МЕ, авторы (7) установили, что при температуре 16°С скорость инактивации вирусов в первые 5 мин витания в большей степени зависит от влажности воздуха и достигает максимума при высоких (80%) и низких (5%) ее значениях. По данным авторов (8), вирус оспы голубей в аэрозоле устойчив при различных значениях относительной влажности, тогда как вирус саркомы Рауса инактивируется при низкой влажности и довольно стабилен лишь при относительной влажности воздуха выше 70%.

Нашими собственными исследованиями установлено, что наименьшая инактивация ряда биокомпонентов при атмосферном высушивании микрокапельных порошков при температуре 25-45°С происходит в диапазоне относительной влажности воздуха от 20 до 80%.

Важным технологическим преимуществом заявляемого способа является получение «чистого» сухого порошкообразного биологически активного материала, не содержащего влагоемкий сорбент. С одной стороны, это повышает устойчивость при хранении сухих биологически активных веществ, так как исключает возможность нежелательного перераспределения влаги между биокомпонентом и сорбентом при изменении термодинамического состояния системы, происходящем в случае существенных колебаний температуры хранения препарата сорбционно-контактной сушки. С другой стороны, значительно расширяет фармацевтический аспект конструирования биопрепаратов, а именно: увеличивает количество возможных готовых форм, как твердых дозированных (таблетки, капсулы, драже, гранулы), так и мягких (суппозиторий, пасты, мази) лекарственных форм, которые могут быть приготовлены на основе сухого порошка, и в которых наличие влагоемкого сорбента нежелательно или недопустимо.

Согласно изобретению снижение инактивации действующих веществ биологической природы в процессе высушивания высокодисперсных биоматериалов, повышение концентрации действующих веществ и снижение инактивации действующих веществ при хранении сухих материалов обеспечивается тем, что жидкую фазу высушивают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С, относительной влажности воздуха 20-80%.

Заявляемый способ конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов является новым и в литературе не описан.

Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов очень часто оценивают по их выживаемости (9), но в данном случае эффективность процесса обезвоживания оценивали по инактивации (10) действующих веществ в биоматериалах. Термин инактивация в данном случае является более уместным и универсальным по сравнению с понятием выживаемость, пригодным для описания живых микроорганизмов, так как подходит по смыслу к характеристике гораздо большего числа эффектов, например, потери активности ферментов растительного происхождения или иммуноглобулинов при их переработке, когда термин выживаемость относителен.

Расчет инактивации действующих веществ осуществляли по формуле

И=100-В,

где И - инактивация действующих веществ, %;

В - выживаемость, %.

Выживаемость микробных клеток в процессе получения микрокапельных порошков рассчитывали по формуле

В=БК_мп×(1+γ)×100/БК_бс,

где БК_мп - концентрация клеток в микрокапельном порошке, КОЕ/г;

БК_бс - концентрация живых клеток в биосуспензии, КОЕ/мл;

γ - отношение массы аэросила к массе биосуспензии в микрокапельном порошке.

Выживаемость микроорганизмов при обезвоживании микрокапельного порошка до промежуточной влажности или в отделенном рассевом сухом порошке определяли по выражению

В=БК_с(п)×(100-W_мп)×100/БК_мп×(100-W_c(п)),

где БК_с(п) - концентрация клеток в обезвоженном микрокапельном порошке или отделенном порошке, КОЕ/г;

W_c(п) - остаточная влажность обезвоженного микрокапельного порошка или отделенного рассевом порошка, %;

W_мп - относительная влажность микрокапельного порошка.

Выживаемость микроорганизмов при приготовлении сухого препарата сорбционным обезвоживанием рассчитывали по формуле

В=БК_п×М_п×100/БК_мп×М_мп,

где БК_п - концентрация микробных клеток в сухом препарате, КОЕ/г;

М_п - масса сухого препарата, г;

М_мп - масса микрокапельного порошка, взятого для приготовления сухого препарата, г.

Количество жизнеспособных энтеробактерий рассчитывали по формуле

БК=N×10^п-1×V/P,

где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;

N - среднее арифметическое числа колоний в пробирках;

п - степень последнего разведения;

V - объем разводящей жидкости, мл;

Р - навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.

Биологическую концентрацию живых аэробных микроорганизмов определяли по выражению

БК=N×10^п+1×V/P,

где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;

N - среднее арифметическое числа колоний на чашках;

п - степень разведения;

V - объем разводящей жидкости, мл;

Р - навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.

Биологическую активность препаратов иммуноглобулинов характеризовали противосальмонеллезной активностью (в титрах РПГА) (11). Концентрацию вакцинного штамма La-Sota вируса болезни Ньюкасла определяли культивированием в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, а биологическую активность вируса оценивали по эмбриональной инфицирующей дозе (ЭИД₅₀), которую рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (12). Стерилизацию гидрофобного аэросила проводили в сухожаровом шкафу SUP-4 при температуре 120°С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов. Относительную влажность воздуха в помещениях измеряли гигрометром М-19.

Осуществление способа изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих снижение инактивации действующих веществ биологической природы в процессе высушивания биоматериалов, повышение концентрации действующих веществ и снижение инактивации действующих веществ при хранении сухих материалов при реализации способа.

Пример 1. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Serratia marcescens шт. ВКМ-851 с лактозной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в электромагнитном диспергаторе. Микрокапельный порошок тест-культуры для проверки фильтров очистки воздуха с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 45,9×10⁹ КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 20%.

Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.

Пример 2. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Bifidobacterium bifidum шт. 1С с сахарозо-молочной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок пробиотического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 1,3×10⁹ КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 80%.

Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.

Пример 3. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Lactobacillus acidophilus штаммов 100aш, NK1 и К₃Ш₂₄ с сахарозо-молочной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок пробиотического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 0,8×10⁹ КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 45°С и относительной влажности воздуха 20%.

Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.

Пример 4. Объект высушивания готовили смешением раствора иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM с глицином (2%) в качестве защитной среды и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок иммунобиологического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентраций белка 40 мг/г и противосальмонеллезной активностью 1:640 в титрах РПГА высушивали при атмосферном давлении при температуре 45°С и относительной влажности воздуха 80%.

Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.

Пример 5. Объект высушивания готовили смешением суспензии вакцинного штамма La-Sota вируса болезни Ньюкасла с защитной средой на основе обезжиренного молока в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок вакцинного препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с содержанием жизнеспособных вирусов 10,7 lg ЭИД₅₀/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 32°С и относительной влажности воздуха 50%.

Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.

Как следует из анализа данных, представленных в таблице, инактивация действующих веществ биологической природы в результате процесса по заявленному способу высушивания снизилась на 16-40%. Высокодисперсные биоматериалы, полученные при реализации заявленного конвективного способа высушивания, при одинаковом влагосодержании обладают в 1,5-9,4 раз большей концентрацией действующих веществ по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом. Кроме того, инактивация действующего вещества в результате хранения сухих материалов, полученных заявленным способом, меньше на 13-42% инактивации хранившихся материалов по прототипу. Указанное обеспечивается высушиванием жидкой фазы из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%.

Источники информации

1. RU, заявка 93027480 A, F26B 5/16, 27.10.1996.

2. RU 2104299 С1.

3. RU 2440105 С2.

4. Ярных B.C. Применение аэрозолей в ветеринарии. - М.: Сельхозиздат, 1962. - 240 с.

5. Влодавец В.В. Определение жизнеспособности бактерий в аэрозоле // Журнал микробиологии. - 1963. - №4. - С. 46-50.

6. Songler J.R. Influence of relative humidity on the survival of some air-borne viruses // Appl. Microbiol. - 1967. - Vol. 15, №1. - P. 35-42.

7. Akers T.I., Bond S.N., Goldberg L.J. Effect of temperature and relative humidity on survival of air-born Columbia-SK group viruses // Appl. Microbiol. - 1966. -Vol. 14, №3. - P. 361-364.

8. Webb S.J., Bather R., Hodges R.W. The effect relative humidity and inositol on airborne viruses // Canad. J. Microbiol. - 1963. - Vol. 9, №1. - P. 87-92.

9. Кинетика измельчения биопрепаратов в аппарате на базе плоского двухстореннего индуктора / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин и др. // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. 1992. Вып. 5-6. С. 51-58.

10. RU 2440098 С2.

11. ФС 42-3347-97.

12. Сюрин В.Н., Белоусов Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. - М.: Колос, 1986.