3-Бромо-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2,4-диоксобутанамид, обладающий антимикробным действием

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса N-гетариламидов 3-бромо-4-(гет)арил-2,4-диоксобутановых кислот, а именно к 3-бромо-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2,4-диоксобутанамиду (1) формулы:

обладающему антимикробным действием, что позволяет предположить его использование в медицинской практике в качестве противомикробного лекарственного средства.

Ближайшим аналогом по структуре заявляемому соединению является 3-бромо-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2,4-диоксо-4-фенилбутанамид (2) [Направленный синтез и поиск фармацевтических субстанций гипогликемического действия в ряду производных 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот / Н.А. Пулина, А.И. Краснова, Ф.В. Собин [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №5. - С. 86-90] формулы:

Данные об антимикробной активности структурного аналога 2 в литературе отсутствуют.

Эталонами сравнения выбраны:

1) хлоргексидин [1,6-ди-(пара-хлорфенилбигуанидо)-гексан] (3), широко применяемый в медицинской практике в качестве антисептического средства [Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - Москва: Новая волна, 2012. - С. 936-937];

2) диоксидин [2,3-ди(оксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид] (4), который используется в лечебной практике как антибактериальное средство [Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - Москва: Новая волна, 2012. - С. 848].

Задачей данного изобретения является поиск веществ с выраженным антимикробным действием и низкой токсичностью в ряду N-гетариламидов 3-бромо-4-(гет)арил-2,4-диоксобутановых кислот.

Поставленная задача достигается получением 3-бромо-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2,4-диоксобутанамида (1), обладающего антимикробной активностью.

Заявляемое соединение 1 синтезируют взаимодействием 2-гидрокси-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-оксобут-2-енамида (5) с бромом при эквимолекулярном соотношении реагентов в среде безводного хлороформа при температуре 20-25°C с последующим выделением целевого продукта известными методами по схеме:

Пример получения соединения 1. К суспензии 3,19 г (0,01 моль) 2-гидрокси-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-оксобут-2-енамида (5) в 20 мл безводного хлороформа добавляли по каплям 1,59 г (0,01 моль) брома при температуре 20-25°C. Полученную реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из 1,4-диоксана. Выход 3,27 г (82%). Т. пл. с разл. 135-137°C. Найдено, %: С 42.31; Н 3.12; N 10.47. C₁₄H₁₂BrN₃O₄S. Вычислено, %: С 42.22; Н 3.04; N 10.55.

ИК-спектр (ФСМ-1201, вазелиновое масло, ν, см^-1): 3136 (NHCO), 1744, 1688, 1664, 1596 (С²=0, С4=O, CONH, С=С, C=N). Спектр ЯМР ¹Н (Varian Mercury Plus (300 МГц), ДМСО-d₆, ГМДС, δ, м.д.): 2.58 с (3H, СН₃), 3.84 с (3H, CH₃O), 7.06 с (1Н, С³Н), 7.08-7.86 м (4Н, C₆H₄, 8.30 с (1H, NH).

Заявляемое соединение 1 представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в 1,4-диоксане, диметилсульфоксиде, умеренно растворимое в бензоле, нерастворимое в воде.

Острую токсичность заявляемого соединения 1 изучали на белых мышах обоего пола массой 18-20 г при пероральном введении с определением ЛД₅₀ согласно методу Г.Н. Першина [Прозоровский, В.Б. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований / В.Б. Прозоровский // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, Вып. 3-4. - С. 2090-2120]. Вещество вводили перорально в виде взвеси в 2% крахмальном растворе из расчета 0,1 мл/10 г, однократно, после чего животные находились под непрерывным наблюдением 24 часа. Общая продолжительность наблюдения составила 2 недели. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / ред. кол.: А.Н. Миронов, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильев [и др.]. - Москва: Гриф и К, 2012. - С. 13-24].

Антимикробная активность соединения 1 определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде по отношению к тест-культурам микроорганизмов (м/о) St. aureus АТСС 6538-Р и Е. coli АТСС 25922 [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / ред. кол.: А.Н. Миронов, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильев [и др.]. - Москва: Гриф и К, 2012. - С. 509-524]. Посевы производили в мясопептонный бульон, рН 7,0 с различной концентрацией испытуемых соединений. Культуры выращивали в пробирках на скошенном мясопептонном агаре. Для определения противомикробной активности использовалась тест-культура в логарифмической или ранней стационарной фазе роста, т.е. для большинства видов микроорганизмов 18-часовая культура. Для приготовления рабочей взвеси микроорганизмов производили смыв выросшей культуры изотоническим раствором хлорида натрия и устанавливали плотность микробной взвеси по стандарту мутности 5 единиц. Далее из полученной микробной взвеси (500 млн. м. т./мл) готовили рабочий раствор бактерий с концентрацией 5 млн. м. т./мл. Данную взвесь микробов вносили в количестве 0,1 мл в пробирки с серийными разведениями изучаемого препарата. Таким образом, микробная нагрузка при определении ПМА составила 250000 м. т./мл. Изучаемое соединение 1 в количестве 0,05 г растворяли в 5 мл диметилформамида; 1 мл полученного разведения 1:100 соединяли с 4 мл мясопептонного бульона (1:500). Затем готовили ряд серийных разведений соединения 1 с двукратно уменьшающейся концентрацией.

Учет результатов производили через 18-20 часов выдержки контрольных и опытных пробирок в термостате при температуре 37°C. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) устанавливали по отсутствию признаков роста микроорганизмов на питательной среде: последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МПК препарата в отношении данного штамма. Антимикробный эффект исследуемого соединения 1 сравнивали с действием хлоргексидина и диоксидина. Результаты исследований обработаны статистически с помощью программы MS Excel 2016 и приведены в таблице 1.

Установлено, что ЛД₅₀ соединения 1 составляет 2390 (1900-3000) мг/кг. Согласно классификации опасности химической продукции, производное 1 относится к 5 классу и является малотоксичным [Юрасова, А.А. Внедрение в Российской Федерации современной модели классификации опасности химической продукции / А.А. Юрасова, А.С. Макарова, Д.О. Скобелев // Токсикологич. вестник. - 2011. - №1 (106). - С. 2-10].

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что, являясь малотоксичным, соединение 1 обладает высоким антимикробным действием. В частности, в отношении St. aureus 6538-Р АТСС производное 1 активнее хлоргексидина и диоксидина в 32 и 16 раз, а по действию на Е. coli 25922 АТСС - в 16 и 8 раз, соответственно.

Таким образом, 3-бромо-4-(4-метоксифенил)-N-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2,4-диоксобутанамид показывает высокую антимикробную активность, а также обладает низкой острой токсичностью, что делает возможным его использование в медицине для создания новых антибактериальных средств.

Литература

1. Направленный синтез и поиск фармацевтических субстанций гипогликемического действия в ряду производных 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот / Н.А. Пулина, А.И. Краснова, Ф.В. Собин [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №5. - С. 86-90.

2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - Москва: Новая волна, 2012. - С. 848, 936-937.

3. Прозоровский, В.Б. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований / В.Б. Прозоровский // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, Вып. 3-4. - С. 2090-2120.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / ред. кол.: А.Н. Миронов, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильев [и др.]. - Москва: Гриф и К, 2012. - С. 13-24, 509-524.

5. Юрасова, А.А. Внедрение в Российской Федерации современной модели классификации опасности химической продукции / А.А. Юрасова, А.С. Макарова, Д.О. Скобелев // Токсикологич. вестник. - 2011. - №1 (106). - С. 2-10.