Синтетический пептид лексицин-1, обладающий антимикробным действием

Антимикробные пептиды, имеющиеся практически у всех изученных многоклеточных организмов, могут быть использованы для создания новых препаратов для лечения инфекций, вызванных резистентными к антибиотикам штаммами бактерий. В отличие от традиционных низкомолекулярных антибиотиков, антимикробным пептидам не свойственно широкое распространение резистентности. Уникальные свойства природных антимикробных пептидов предположительно являются следствием длительной эволюции, в результате которой сформировался определенный репертуар пептидов и их механизм действия [Peschel and Sahl. 2006. The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat. Rev. Microbiol. 4, 529-536]. В отличие от классических антибиотиков, катионные антимикробные пептиды преимущественно атакуют внутреннюю мембрану бактериальных клеток. Существуют различные механизмы мембранолитического действия антимикробных пептидов, но все они включают формирование определенной амфифильной конформации пептида при взаимодействии с липидной мембраной [Powers and Hancock. 2003. The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides 24, 1681-1691]. Поскольку амфифильная конформация поддерживается элементами вторичной структуры, в множестве природных антимикробных пептидов можно выделить два основных структурных класса - альфа-спиральные и бета-листовые пептиды [Nguyen et al. 2011. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. Trends Biotechnol. 29, 464-472].

Терапевтическое применение требует разработки новых антимикробных пептидов с повышенной активностью по отношению к патогенным бактериям, пониженной токсичностью, а также простой химической структурой для упрощения и удешевления их синтеза. Существующие подходы к конструированию пептидов с улучшенными характеристиками рассмотрены в обзоре Fjell и соавторов (Fjell et al. 2011. Designing antimicrobial peptides: form follows function. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 37-51). Большинство методов направленной оптимизации свойств антимикробных пептидов основано на внесении модификаций в последовательность известного природного пептида. Несмотря на то, что такая стратегия может быть очень эффективна, она ограничивает пространство возможных вариантов близкими гомологами исходного пептида.

Изобретение решает задачу расширения репертуара высокоактивных антимикробных пептидов широкого спектра действия, имеющих небольшую длину и простую линейную химическую структуру.

Поставленная задача решается путем создания нового антимикробного пептида лексицина-1 с использованием вычислительных методов. Для конструирования пептида применен т. н. «лингвистический» подход, основанный на аналогии между аминокислотных остатков, обладает линейной химической структурой и имеет следующую аминокислотную последовательность:

Lys¹-Ile²-Gly³-Val⁴-Leu⁵-Lys⁶-Lys⁷-Tyr⁸-Phe⁹-Lys¹⁰-Ile¹¹-Gly¹²-Ala¹³-Leu¹⁴-Ile¹⁵-Lys¹⁶-Ala¹⁷-Ile¹⁸-Ile¹⁹-Lys²⁰-NH₂.

Заявляемый пептид получается методом твердофазного химического синтеза и очищается при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Синтетический лексицин-1 проявляется высокую антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Минимальные ингибирующие концентрации пептида по отношению к перечисленным патогенам составляют 1-8 мкМ. В растворе пептид не имеет выраженной вторичной структуры, но при взаимодействии с анионными и цвиттерионными липидными мицеллами, моделирующими бактериальную мембрану, приобретает альфа-спиральную конформацию.

Наиболее близким к заявляемому пептиду по вторичной структуре и биологическим свойствам является природный антимикробный пептид магейнин-2 и его оптимизированный аналог пексиганан. Магейнин-2 и пексиганан состоят из 23 и 22 аминокислотных остатков соответственно, являются катионными амфифильными пептидами, и аналогично заявляемому пептиду приобретают альфа-спиральную конформацию при взаимодействии с липидными мембранами. Минимальная ингибирующая концентрация магейнина-2 и пексиганана в отношении грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa составляет 14 мкМ [Zasloff et al. 1988. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 910-913] и 3 мкМ [Ge et al. 1999. In vitro antibacterial properties of pexiganan, an analog of magainin. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 782-788] соответственно.

Простая химическая структура пептида без дисульфидных связей и относительно небольшая длина позволяют эффективно получать его как при помощи химического синтеза, так и биотехнологическими методами. Заявляемый пептид представляет собой новое химическое соединение и не имеет близких гомологов среди известных белков и пептидов.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Конструирование пептида лексицина-1.

Для конструирования пептида лексицина-1 были использованы паттерны аминокислотных последовательностей, найденные в природных антимикробных пептидах с альфа-спиральной структурой. Для этого из базы данных антимикробных пептидов APD2 [Wang et al. 2009. APD2: the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design. Nucleic Acids Res. 37, D933-D937] были отобраны 273 альфа-спиральных пептида, активных в отношении грамположительных или грамотрицательных бактерий. Паттерны в аминокислотных последовательностях отобранных пептидов были найдены при помощи алгоритма Teiresias [Rigoutsos and Floratos. 1998. Combinatorial pattern discovery in biological sequences: the TEIRESIAS algorithm. Bioinformatics 14, 55-67]. Под паттерном понимается последовательность, неоднократно встречающаяся в различных пептидах и состоящая из определенных аминокислотных остатков и пропусков, на месте которых может находится любой аминокислотный остаток. Примером паттерна служит последовательность K-FK, в которой символ «-» обозначает любой аминокислотный остаток, буквы K обозначают остатки лизина, а F - остаток фенилаланина.

Из трех паттернов KI----K, K-FK и K-I-K, выделенных из отобранных пептидов из базы данных, был составлен шаблон следующего вида: KI----K-FKI----K-I-K. Затем пропуски в указанном шаблоне были заполнены аминокислотными остатками, в результате чего была получена аминокислотная последовательность пептида: KIGVLKKYFKIGALIKAIIK. После конструирования аминокислотной последовательности была проведена проверка того, что гомология полученного пептид с любым известным антимикробным пептидом из базы данных не превышает 40%.

Пример 2. Химический синтез пептида лексицина-1

Для химического синтеза использовались реактивы и производные аминокислот фирм Iris Biotech (Германия) и AAPTEC (США); полимеры Rink amide Chemmatrix (PCAS BioMatrix Inc., Канада) и Rink amide MBHA (Iris Biotech) с содержанием аминогрупп 0,52 ммоль/г и 0,65 ммоль/г, соответственно. Диметилформамид перед использованием перегонялся в вакууме и хранился над молекулярными ситами 4 Å. Индивидуальность производных аминокислот контролировалась методом тонкослойной хроматографии на пластинках Merck F 254 (Германия) в системах растворителей: 1% аммиак-втор-бутиловый спирт, 1:3 (А); хлороформ-этилацетат-метанол, 20:10:3 (Б); хлороформ-метанол-уксусная кислота, 90:7:3 (В). Визуализация хроматограмм проводилась в УФ свете при длине волны 254 нм хлор-бензидиновым методом.

Для защиты боковой цепи тирозина использовалась t-Bu-группа, лизина - Boc-группа. В качестве временной α-N-защиты служила Fmoс-группировка. Наращивание пептидной цепи проводилось по следующему протоколу для каждого цикла: 1) CH₂Cl₂ (1 мин); 2) диметилформамид (1 мин); 3) 20% пиперидин/диметилформамид (2 и 8 мин); 4) диметилформамид (3 х 1 мин); 5) изопропиловый спирт (3 х 1 мин); 6) диметилформамид (3 х 1 мин); 7) реакция конденсации (2 ч); 8) диметилформамид (2 х 1 мин); 9) CH₂Cl₂ (1 мин). Для конденсации использовались четырехкратные избытки активированных 1-гидрокси-6-хлорбензотриазоловых эфиров соответствующих Fmoc-аминокислот, полученных in situ (по 1 экв. Fmoc-аминокислоты, N,N'-диизопропилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола, перемешивание в диметилформамиде при 0°C, 30 мин). Отщепление синтезированного пептида от полимера с одновременным деблокированием осуществлялось с помощью смеси TFA:H₂O:TIS (95:2,5:2,5) в течение 3 ч. Полимер отфильтровывался, реакционная смесь упаривалась и остаток растирался с метил-трет-бутиловым эфиром (MTBE). Выпавший продукт отфильтровывался, промывался MTBE и высушивался в вакууме.

Очистка деблокированного пептида осуществлялась при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ проводилась с использованием хроматографа System Gold (Beckman, США) на колонках Luna C₁₈, 4,6x150 мм, зернение 5 мкм для аналитической хроматографии и YMC Triart C₁₈ 10х250 мм, зернение 5 мкм для препаративной. Условия хроматографии: градиент ацетонитрила в 0,1% H₃PO₄ при скорости потока 1 мл/мин для аналитической и 5 мл/мин для препаративной хроматографии, УФ детекция при длине волны 220 нм. Чистота пептида после хроматографии составляла не менее 95%. После очистки пептид подвергался обработке амберлитом IRA-67 в ацетатной форме и последующей лиофилизации. Идентичность пептида была подтверждена при помощи масс-спектрометрии на приборе micrOTOF 10223 (Bruker) с источником ионов типа электроспрей. Расчетная моноизотопная масса для формулы пептида C₁₁₁H₁₉₅N₂₇O₂₁ составляет 2242,502 Да, наблюдаемая экспериментально масса составила 2242,49 Да.

Пример 3. Определение вторичной структуры пептида лексицина-1 в водном растворе и при связывании с липидными мицеллами.

Для определения вторичной структуры синтетического пептида был применен метод спектроскопии кругового дихроизма в дальнем УФ диапазоне. Все пробы для проведения измерений были приготовлены в буферном растворе 10 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 мМ NaF, pH 7,4. Раствор очищенного синтетического пептида был разбавлен до конечной концентрации 30 мкМ. Для изучения взаимодействия пептида с липидными мицеллами были приготовлены пробы с анионными мицеллами додецилсульфата натрия (SDS) и цвиттерионными мицеллами додецилфосфохолина (DPC). Соотношение молярных концентраций пептида и липидов лежало в диапазоне от 1:1000 до 1:1500 во всех экспериментах, таким образом концентрация липидов была выше критической концентрации мицеллообразования. Перед измерениями пробы были проинкубированы при температуре 25°C в течение 1 часа.

Все измерения были проведены на спектрометре Chirascan (Applied Photophysics) в диапазоне длин волн 180-260 нм с шагом 1 нм. Полученные спектры были усреднены по 3-5 измерениям и приведены на чертеже. На графике A приведен спектр кругового дихроизма пептида в растворе без липидов, соответствующий бесструктурному клубку. Как видно из графиков B и C, при добавлении липидных мицелл пептид приобретает ярко выраженную альфа-спиральную конформацию, что видно по характерному спектру кругового дихроизма. Количественный анализ спектров кругового дихроизма был проведен при помощи алгоритма CDSSTR [Compton and Johnson.1986. Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication. Anal. biochem. 155, 155-167]. Среднее содержание альфа-спиральных элементов в пептиде в водном растворе равнялось всего 1%, тогда как при взаимодействии с липидными мицеллами спиральность повышалась до 61% и 78% в случае анионных и цвиттерионных мицелл, соответственно.

Пример 4. Определение антимикробной активности пептида лексицина-1 по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям.

Для определения антимикробной активности синтетического пептида были измерены минимальные ингибирующие концентрации, необходимые для полного подавления роста бактерий. Измерения проводились методом серийных микроразведений в соответствии со стандартным протоколом [Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition, CLSI document M07-A9, p. 16-19, Wayne, PA]. Двукратный стоковый раствор пептида и серия разведений были приготовлены в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,05% бычьего сывороточного альбумина. Стерилизация растворов проведена путем фильтрации через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Определение антимикробной активности проведено на двух грамположительных бактериях, Staphylococcus aureus штамма ATCC 25923 и Listeria monocytogenes штамма EGD и двух грамотрицательных бактериях, Pseudomonas aeruginosa штамма ATCC 27853 и Escherichia coli штамма ATCC 25922. Бактериальные культуры выращивались в среде Мюллера-Хинтона при температуре 37°C до логарифмической фазы, после чего разводились до плотности 2х10⁵ КОЕ/мл. После этого 25 мкл бактериальной суспензии смешивались с 25 мкл раствора пептида и инкубировались в течение 18 ч при температуре 37°C. Минимальная ингибирующая концентрация определялась как минимальная концентрация пептида, полностью подавляющая рост бактерий. Результаты измерений, приведенные в таблице, являются медианными значениями, полученными из 3-5 независимых экспериментов, каждый из которых был проведен в трех повторах. Как видно из таблицы, синтетический лексицин-1 проявляет высокую активность по отношению ко всем протестированным бактериям, как грамположительным, так и грамотрицательным.

Таблица - Антимикробная активность синтетического пептида лексицина-1. Данные по антимикробной активности природного пептида магейнина-2 взяты из статьи Zasloff et al. 1988. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 910-913

Подпись к чертежу

A. Спектр кругового дихроизма пептида в дальнем УФ диапазоне, измеренный в водном растворе 10 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 мМ NaF, pH 7,4. Деконволюция спектра при помощи алгоритма CDSSTR дает содержание альфа-спиральных участков 1%.

B. Спектр кругового дихроизма пептида в дальнем УФ диапазоне, измеренный в водном растворе 10 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 мМ NaF, pH 7,4 c анионными мицеллами додецилсульфата натрия (SDS). Деконволюция спектра при помощи алгоритма CDSSTR дает содержание альфа-спиральных участков 61%.

C. Спектр кругового дихроизма пептида в дальнем УФ диапазоне, измеренный в водном растворе 10 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 мМ NaF, pH 7,4 c цвиттерионными мицеллами додецилфосфохолина (DPC). Деконволюция спектра при помощи алгоритма CDSSTR дает содержание альфа-спиральных участков 78%.