Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего рецессивный генетический дефект крупного рогатого скота абердин-ангусской породы дупликации развития (DD), и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Одной из задач Государственной программы развития сельского хозяйства на 2013-2020 годы является развитие мясного скотоводства. Важнейшую роль в процессе ускоренного развития этой отрасли играет практически заново сформированная племенная база за счет использования лучших племенных ресурсов [Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы. Утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 14 июля 2012 г. №717, с. 66.], что, отчасти, достигается импортом племенного материала крупного рогатого скота мясного направления продуктивности из-за рубежа.

Однако, практически у всех мясных пород зарубежной селекции были выявлены генетические дефекты, проявление которых вместо ожидаемой пользы может нанести серьезный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33].

Одним из нежелательных генетических дефектов крупного рогатого скота является дупликация развития (Developmental duplication, DD). Нежелательный гаплотип был картирован на хромосоме 26 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.org/OMIA002103/9913/ (дата обращения 07.02.2017)].

Причиной DD является точковая мутация - замена тимина на цитозин в позиции 34618072 (g.34618072T>C) во втором гене, содержащем повторы NHL, в результате которой происходит замена аминокислоты валин на аланин в кодируемом белке (OMIA 002103-9913) [Beever, J.E., Marron, В.М., Parnell, P.F., Teseling, C.F., Steffen, D.J., Denholm, L.J.: Developmental Duplications (DD): 1. Elucidation of the underlying molecular genetic basis of polymelia phenotypes in Angus cattle. Proc. XXVIII World Buiatrics Congress, Cairns Australia: Abstract 0106, 2014; http://omia.org/OMIA002103/9913/].

Основным признаком заболевания является появление телят с большим, чем в норме, количеством отдельных частей тела (чаще всего дополнительных конечностей). Существует ряд фенотипов, связанных с этой болезнью, которые классифицируются в соответствии с точкой прикрепления дополнительной конечности к телу. Общим является только то, что все они представлены дополнительными тканями организма. Больные животные могут быть рождены с дополнительной конечностью (конечностями), лишними лоскутами кожи на голове или как «двухголовые» телята [L. Denholm, 2011. Developmental duplications (DD) in Angus calves [Электронный ресурс] URL: http://www.flockandherd.net.au/cattle/reader/developmental-duplication-angus.html]. За исключением смертности, связанной с трудными отелами, эти телята часто могут успешно развиваться, особенно если экстраконечности были удалены хирургически [М. McClure, J. McClure. Genetic Disease and Trait Information for IDB Genotyped Animals in Ireland. 2016]. Заболевание наследуется по простому рецессивному типу наследования с неполной пенетрантностью. Т.е. не все гомозиготные животные будут проявлять видимые деформации. Пенетрантность фенотипа DD оценивается значением 54%, при этом 46% от ожидаемого числа гомозигот визуально нормальные особи, несмотря на то, что некоторые из этих животных, вероятно, имеют субклинические поражения, характерные для DD и развивают клинические признаки в более позднее время.

Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что за рубежом частота встречаемости животных-носителей дефекта дупликации развития довольно высока и составляет 20,4% [Konovalova E.N., Gladyr' Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Journal of Agriculture and Environment, 2017, p. 3].

Ряд зарубежных лабораторий осуществляет диагностику порока дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы путем анализа ДНК методом ПЦР (Лаборатория генетики животных в Школе ветеринарии Университета Квинсленда, Корпорация Neogen (GeneSeek), Линкольн, Небраска и Zoetis Inc.) [http://omia.org/OMIA002103/9913/]. Однако, описание используемых ими методов в доступных источниках не обнаружено.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения дефектного аллеля в гене NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC, с целью идентификации скрытых носителей DD и разработки программ их использования в селекции без риска получения больных телят.

Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в гене NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего нежелательный генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации фрагмента ДНК области мутации используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 п.н. с температурой плавления 59°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, образующие в ходе ПЦР ампликон длиной 404 п.о., который затем подвергают ПДРФ-анализу при помощи фермента BstMW I (эндонуклеазы рестрикции) с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG), разрезающий ПЦР-продукт в случае наличия мутации на два фрагмента ДНК - 320 п.н. и 84 п.о., а при электрофорезе в агарозном геле у животных-носителей мутации визуализируют два фрагмента ДНК 404 п.о. и 320 п.о., фрагмент длиной 84 п.о. - невидим, в случае отсутствия мутации ПЦР-продукт не разрезается и на электрофорезе наблюдают один фрагмент длиной 404 п.о.

Данный подход имеет следующие преимущества: 1) отсутствие различий между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина позволяют легче оптимизировать температурно-временные условия ПЦР; 2) длина фрагментов ДНК, получаемых в ходе ПЦР и ПДРФ анализа оптимальна для визуализации их в агарозном геле; 3) использование эндонуклеазы рестрикции обуславливает высокую специфичность метода.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании метода ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Разрабатываемый способ базируется на определении точковой мутации во втором гене, содержащем повторы NHL (NHLRC2), в ходе которой происходит замена тимина на цитозин в позиции 34618072 (g.34618072T>C). С этой целью был выбран участок гена NHLRC2 крупного рогатого скота внутри точковой мутации и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по гену NHLRC2 (n=60) были использованы образцы ткани (ушной вышип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования разработанного способа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 404 п.о. Путем дальнейшего ПДРФ-анализа получали следующие фрагменты ДНК: 404 п.о., характерного для здорового аллеля, 320 п.о. - характерный для мутантного аллеля и 86 п.о. - характерный для мутантного аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа DDC на основе метода ПЦР-ПДРФ (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом DDC (носитель DD) и 55 образцов с генотипом DDF (не носитель).

Определение полиморфизма гена предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации SNP были подобраны два праймера -смысловой и антисмысловой, одинаковые по температуре плавления (59°С) и GC-содержанию (55%).

DDI - 5'-AGA GGC ATG ATG AAG GCG AG

DD3 - 5'-CCA AGG GGA ACT AAT GGG CT

Продукт амплификации праймеров DD1 и DD3 характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 404 п.о. Участок мутации помечен звездочкой. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67.7 мМ Трис HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 61°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 4 мин;

3. В ходе ПДРФ-анализа полученный ПЦР-продукт подвергался воздействию эндонуклеазы рестрикции BstMW I с сайтом узнавания GCNNNNN↑NNGC (CGNN↓NNNNNCG) (где N обозначает аденин, гуанин, цитозин или тимин) при температуре 55°С в течение 12 ч, и при наличии мутации происходило его разрезание на два фрагмента ДНК: 320 п.о., видимый на электрофореграмме и 86 п.о. - невозможно визуализировать вследствие малого размера при данных условиях электрофореза.

4. Определение аллелей DDC и DDF гена NHLRC2 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1× ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу DDF (не носителю DD) соответствует фрагмент длиной 404 п.о., генотипу DDC (носителю DD) - два фрагмента длиной 404 и 320 п.о. и генотипу DDI (не встречался) - фрагмент длиной 320 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;

5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма гена NHLRC2 было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=1253 голов, четыре популяции) породы, разводимой в различных регионах Российской Федерации. Исследование выявило наличие 98 животных с генотипом DDC (носители DD). Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями точковой мутации в гене NHLRC2, ассоциированной с гаплотипом DDC.

Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля DDC гена NHLRC2, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене NHLRC2 крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, ассоциированного с гаплотипом DDC, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.