Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный генетический дефект множественного артрогрипоза крупного рогатого скота мясных пород

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект крупного рогатого скота мясных пород множественный артрогрипоз (AM), и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Одной из задач Государственной программы развития сельского хозяйства на 2013-2020 годы является развитие мясного скотоводства. Важнейшую роль в процессе ускоренного развития этой отрасли играет практически заново сформированная племенная база за счет использования лучших племенных ресурсов [Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы. Утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 14 июля 2012 г. №717, с. 66.], что, отчасти, достигается импортом племенного материала крупного рогатого скота мясного направления продуктивности из-за рубежа.

Однако, практически у всех мясных пород зарубежной селекции были выявлены генетические дефекты, проявление которых вместо ожидаемой пользы может нанести серьезный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33].

Одним из летальных генетических дефектов крупного рогатого скота является множественный артрогрипоз (Arthrogriposis multiplex, AM). Летальный гаплотип был картирован на хромосоме 16 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.angis.org.au/home (дата обращения 25.01.2017)].

Причиной AM является обширная деления (23347 п.о.), охватывающая три гена (полностью удаляется ген убиквитино-подобного модификатора (ISG15), 5' регуляторный регион гена волос и усилителя расщепления (HES4) и/или два первых экзона гена агрина (AGRN)) (OMIA 002135-9913) [Beever J.E. Likely presence of lethal genetic defect in a specific line of Angus cattle.2008. http://www.angus.org/pub/am/aaa_notice.pdf].

Телята, гомозиготные по мутантному аллелю, характеризуются нарушением нервно-мышечного взаимодействия, вследствие чего развиваются такие клинические признаки как аномальный изгиб спины (сколиоз или кифоз), мышечная гипоплазия, умеренная гидроцефалия. Больные телята рождаются мертвыми или умирают вскоре после рождения [Beever, Jon. 2008. An Update on Arthrogryposis Multiplex in Cattle. Website of the American Angus Association. (http://www.angus.org/NAAB_release.pdf accessed 11-22-2009)].

Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что за рубежом среди быков дефект множественного артрогрипоза практически полностью искоренен, а среди коров носительство данной аномалии остается на стабильно высоком уровне (12,0%) [Konovalova E.N., Gladyr" Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Journal of Agriculture and Environment, 2017, p. 3].

Известен способ диагностики полиморфизма в генах AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с AM, и взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что выделенная из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК исследуется методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех олигонуклеотидных праймеров: одного прямого и двух обратных, имеющих длину 22 нуклеотида, температуру плавления 64-68°С и содержание гуанина-цитозина 45,5-54,5%. При этом у животных-носителей порока выявляется два фрагмента ДНК: 576 п. о., соответствующий здоровому аллелю, и 507 п.о., соответствующий мутантному аллелю [WO 2011/075144, C12Q 7/68 (2006.07].

Данный способ является высокоспецифичным и позволяет выявлять животных-носителей множественного артрогрипоза независимо от пола и возраста.

Однако, он имеет следующие недостатки: 1) наличие различий между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина делает затруднительным оптимизацию температурно-временных условий ПЦР; 2) дизайн метода предполагает амплификацию в ходе ПЦР фрагментов ДНК длиной свыше 500 п.о., что возможно лишь при использовании ДНК высокой степени очистки; 3) разница между длиной здорового аллеля и дефектного, составляющая 69 п.о., затрудняет визуализацию фрагментов ДНК в агарозном геле при электрофорезе, что может приводить к получению ложноотрицательного результата.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения дефектного аллеля генов AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с гаплотипом АМС, с целью идентификации скрытых носителей AM и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.

Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в генах AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с гаплотипом АМС, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный генетический дефект множественного артрогрипоза крупного рогатого скота мясных пород, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 58-60°С и содержанием гуанина-цитозина 45-50%, и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 357 п.о. для здорового аллеля и 242 п.о. - для мутантного.

Данный подход имеет следующие преимущества: 1) минимальные различия между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина позволяют легче оптимизировать температурно-временные условия ПЦР; 2) меньшая длина олигонуклеотидных праймеров несколько снижает их стоимость; 3) образование в ходе ПЦР фрагментов ДНК до 500 п.о. дает возможность использовать данный способ при работе с ДНК не высокого качества; 4) разница в длине между здоровым и мутантным аллелем в 115 п.о. лучше визуализируется на электрофореграмме, что сводит к минимуму возможность ошибочной интерпретации результатов.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю, ассоциированному с АМС, соответствует фрагмент длиной 242 п.о., а нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент длиной 357 п.о., что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели генов AGRN, ISG15 и HES4 методом электрофореза в агарозном геле.

Разрабатываемый способ базируется на определении делеции, охватывающей три гена (полностью удаляется ген убиквитино-подобного модификатора (ISG15), 5' регуляторный регион гена волос и усилителя расщепления (HES4) и/или два первых экзона гена агрина (AGRN)) размером 23347 п.о. С этой целью был выбран участок генов AGRN, ISG15 и HES4 крупного рогатого скота внутри делеции и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по AGRN, ISG15 и HES4 (n=60) были использованы образцы ткани (ушной выщип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 576 п. о., характерного для мутантного аллеля и 507 п.о., характерного для здорового аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа АМС на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом АМС (носитель AM) и 55 образцов с генотипом AMF (не носитель).

Определение полиморфизма HES4, ISG15 и AGRN предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации делеции были подобраны два обратных праймера, специфичных для здорового и дефектного аллеля (AMV2, AMV3), и одного общего прямого праймера (AMV1):

AMV1 - 5'-CGAAAGCCTTCTTTCCACTG

AMV2 - 5'-TTCTGCAGGCAAGAACACTG

AMV3 - 5'-GAATGCCACTTCCTCCTCTG

Продукт амплификации праймеров AMV1 и AMV3 характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 357 п.о., продукт амплификации праймеров AMV1 и AMV2 характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 242 п.о. Участок делеции помечен звездочками. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 65,5°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;

3. Определение аллелей АМС и AMF генов HES4, ISG15 и AGRN осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу AMF (не носителю AM) соответствует фрагмента длиной 357 п.о., генотипу АМС (носителю AM) - два фрагмента длиной 357 и 242 п.о. и генотипу AMI (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 242 п.о. (Фиг. 1В). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;

4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма генов HES4, ISG15 и AGRN было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=857 голов, шесть популяций) и герефордской (n=124, одна популяция) пород. Исследование выявило наличие 7 животных с генотипом АМС (носители AM). Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями делеции в генах HES4, ISG15 и AGRN, ассоциированной с гаплотипом АМС.

Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля АМС генов AGRN, ISG15 и HES4, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в генах HES4, ISG15 и AGRN крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом АМС, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.