Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИМОРФИЗМА АРОВ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩЕГО ЛЕТАЛЬНЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ДЕФЕКТ ГОЛШТИНСКОГО СКОТА HCD - ДЕФИЦИТ ХОЛЕСТЕРИНА

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена аполипротеина В (АРОВ), обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект голштинского скота HCD, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Практикуемая в течение последних десятилетий стратегия селекции на быков-лидеров [Лабинов В.В. Модернизация черно-пестрой породы крупного рогатого скота в России на основе использования генофонда голштинов / В.В. Лабинов, П.Н. Прохоренко // Молочное и мясное скотоводство. - 2015. - №1. - С. 2-7; Сермягин А.А. Перспективы использования оценки геномной племенной ценности в селекции молочного скота / А.А. Сермягин, Е.Н. Нарышкина, Т.В. Карпушкина, Н.И. Стрекозов, Н.А. Зиновьева // Молочное и мясное скотоводство. - 2015. - №7. - С. 2-5] привела к существенному росту уровня гомозиготности в большинстве культурных пород крупного рогатого скота. Так, например, в американской и канадской популяциях голштинской породы средний коэффициент инбридинга в настоящее время оценивается, соответственно, на уровне 6,53% [VanRaden P., Null D. Inbreeding Trend for Holstein or Red & White Cows // CDCB, Council on dairy cattle breeding, 2015. URL: https://www.cdcb.us/eval/summary/inbrd.cfm? (дата обращения 27.02.2016)] и 6,81% [Inbreeding Update // CDN, Canadian Dairy Network, Aug. 2015. URL: https://www.cdn.ca/document.php?id=411 (Дата обращения 03.03.2016)]. Рост гомозиготности, в свою очередь, обусловливает возрастание негативного влияния летальных рецессивных генетических дефектов, которые в гомозиготном состоянии приводят к эмбриональной смертности или гибели теленка в ранний постэмбриональный период. В базе данных OMIA [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.angis.org.au/home (дата обращения 02.03.2016)] сегодня содержится информация о 213 наследственных заболеваниях и других моногенных признаках, для 116 из которых идентифицированы соответствующие причинные мутации. Моногенные наследственные заболевания идентифицированы практически во всех породах молочного крупного рогатого скота, и постоянно регистрируются случаи появления новых [Зиновьева Н.А. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Н.А. Зиновьева, Н.И. Стрекозов, Г.В. Ескин, И.С. Турбина, И.Н. Янчуков, А.Н. Ермилов // Животноводство России. - 2015. - №6. - С. 30-31]. Особенное негативное значение имеют дефекты, приводящие к гибели телят в ранний постэмбриональный период. В июле 2015 года на конференции Interbull в Орландо (США) было сообщено о регистрации нового летального гаплотипа голштинского скота, картированного на хромосоме 11 [Kipp, S., D. Segelke, S. Schierenbeck, F. Reinhardt, R. Reents, C. Wurmser, H. Pausch, R. Fries, G. Thaller, J. Tetens, J. Pott, M. Piechotta, and W. . A new Holstein haplotype affecting calf survival. Interbull Bull. 2015. 49: 49-53]. Телята-носители характеризуются нарушением в метаболизме холестерина, что приводит к потере веса, аппетита, физической слабости, диарее, не поддающимся медикаментозному лечению. Следствием является гибель телят в первые недели или месяцы жизни. Было установлено, что гетерозиготные животные имеют пониженное содержание холестерина в крови, в то время как у гомозиготных животных холестерин в крови вообще отсутствует. Новый гаплотип получил название гаплотипа дефицита холестерина - HCD.

Гаплотип HCD локализован на ВТА11 в области экзона 5 гена АРОВ (сборка генома UMD 3.0) [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410], причиной HCD является инсерция мобильного LTR элемента (ERV2-1) размером 1299 bp после позиции 77 958 994 на ВТА 11, расположенная между нуклеотидами 24 и 25 экзона 5 гена АРОВ. Инсерция обусловливает сдвиг рамки считывания, начиная от аминокислоты 135 АРОВ, и приводит к отсечению 97% соответствующего белка длиной 4567 аминокислот (Gly135ValfsX10). С. Charlier [Charlier С. The role of mobile genetic elements in the bovine genome // Plant Anim. Genome XXIV Conf., 2016. abstr. W636] подтвердил локализацию мутации, при этом указав, что полный размер инсерции эндогенного ретровирусного элемента (BoERV) составляет около 7 kb.

Частота скрытых носителей HCD среди телок канадской популяции 2012 года рождения составляла 17% и оценивается на уровне менее 12% для телок 2016 года рождения [Van Doormaal В., Beavers L. HCD: Haplotype associated with Cholesterol Deficiency // Canadian Dairy Network (CDN), Dec. 2015. URL: https://www.cdn.ca/images/uploaded/file/HCD%020Update%20Article%20-%20December%202015.pdf (Дата обращения 03.03.2016).]. В США частота скрытых носителей HCD, выявленных посредством полногеномного анализа 826948 животных, составляет 6,0%, в том числе 4,4% подтвержденных по родословной и 1,6% - не подтвержденных по родословной [Van Raden P., Null D. Holstein Haplotype for Cholesterol Deficiency, HCD // USDA-AGIL, 2015. URL: https://www.cdcb.us/reference/changes/HCD_inheritance.pdf (дата обращения 05.03.2016 г.)]. Из 264 протестированных быков, используемых в системе искусственного осеменения в Германии, 46 (17,4%) оказались скрытыми носителями HCD, что соответствует частоте встречаемости мутантного аллеля 8,7% [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet, doi:10.1111/age.12410].

Проведенный анализ родословных 584 быков-производителей, используемых в системе искусственного осеменения в РФ, и базы данных скрытых носителей HCD Департамента сельского хозяйства США [Bulls' status for haplotypes impacting fertility on the records of Holstein Association USA // Holstein Association USA, 14.12.2015. URL: www.holsteinusa.com/pdf/haplotype/hapbulcarriers (Дата обращения 05.03.2016)], показал, что у 60 быков (10,3%) отцы являются носителями HCD. Вышеназванные отцы принадлежат к нескольким генеалогическим линиям, имеют различное происхождение (канадское, американское, австрийское) и активно используются в племенной работе.

Анализ научно-технической, патентной и иной информации показал, что единственным применяемым сегодня способом диагностики полиморфизма в АРОВ, ассоциированного с HCD, используемым в качестве аналога, является использование ПЦР-анализа [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, E. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410]. Однако проведение ДНК-диагностики данным способом характеризуется тем, что здоровый аллель имеет длину фрагмента меньше 249 п.о., чем дефектный аллель - 436 п.о., тем самым для амплификации здорового аллеля создаются лучшие условия, что, в свою очередь, может привести к ложноотрицательным результатам, обусловленным неспецифической амплификацией.

В качестве прототипа заявленного способа наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату можно считать проведение ПЦР [Menzi, F., N. Besuchet-Schmutz, М. , S. Hofstetter, V. Jagannathan, Т. Mock, A Raemy, Е. Studer, K. Mehinagic, N. Regenscheit, M. Meylan, F. Schmitz-Hsu, and C. . 2016. A transposable element insertion in АРОВ causes cholesterol deficiency in Holstein cattle // Anim. Genet., doi:10.1111/age.12410].

Основной недостаток прототипа заключается в том, что при ПЦР длина фрагмента здорового аллеля существенно меньше по сравнению с мутантным (249 против 436 п.о.), что создает риск получения ложно отрицательных результатов, поскольку для амплификации здорового аллеля созданы предпочтительные условия.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля А гена АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, с целью идентификации скрытых носителей HCD и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.

Задача изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в гене АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ определения полиморфизма АРОВ, ассоциированного с гаплотипом HCD, для использования в селекции крупного рогатого скота, включающий специфичный однопробирочный метод полимеразной цепной реакции, позволяющий проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле без использования дорогостоящего оборудования, что обеспечит относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю А, ассоциированному с HCD, соответствует фрагмент меньшей длины, в то время как нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент большей длины, что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели гена АРОВ методом электрофореза в агарозном геле.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно выявление мутантного аллеля А гена АРОВ, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Сущность изобретения - определение полиморфизма гена АРОВ ассоциированного с гаплотипом HCD крупного рогатого скота, методом ПЦР.

Разрабатываемый способ базируется на определении инсерции мобильного LTR элемента (ERV2-1) размером 1299 bp после позиции 77 958 994 на ВТА 11, расположенной между нуклеотидами 24 и 25 экзона 5 гена АРОВ. С этой целью выбран участок гена АРОВ крупного рогатого скота внутри инсерции и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по АРОВ (n=60) были использованы образцы ткани (ушной выщип, n=30) и спермы (n=30) быков и коров голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы. ДНК выделяли методом экстракции перхлоратом [Зиновьева Н.А. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ, 2002, 112 с.], с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Каждым из вышеназванных методов выделяли ДНК из 10 образцов ткани и 10 образцов спермы. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 436 п.о., характерного для мутантного аллеля, и 249 п.о., характерного для здорового аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа HCD на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

На фиг. 1А представлен дизайн теоретически смоделированной тест-системы.

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом AN (скрытый носитель HCD) и 55 образцов с генотипом NN (неноситель).

Определение полиморфизма АРОВ предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации инсерции были подобраны два обратных аллелеспецифических праймера специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера:

APOB_Norm_NEW - 5' - GCA GCT GAG ССС ACG АТС СА

APOB_Aff_NEW - 5' - AAA TGC TCG AGA ATA TCC GGG G

APOB_For_NEW - 5' - GCT GCA AAG CCA CCT AGC CT

Продукт амплификации праймеров APOB_Norm_NEW и APOB_For_NEW характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 327 п.о., продукт амплификации праймеров APOB_Aff_NEW и APOB_For_NEW характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 215 п.о. Место вставки инсерции помечено звездочкой. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67.7 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1,5 мМ MgCl₂, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 7 мин, 35 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 67°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.

3. Определение аллелей N и А гена АРОВ осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 20 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ), при этом генотипу NN (неносителю HCD) соответствует фрагмента длиной 327 п.о., генотипу AN (скрытому носителю HCD) - два фрагмента длиной 327 и 215 п.о. и генотипу АА (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 215 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия.

4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма АРОВ было апробировано на выборке племенного поголовья голштинского и голштинизированного черно-пестрого, в том числе 483 быках-производителях и 487 коровах. Исследование выявило наличие 53 животных с генотипом AN (скрытые носители HCD), в том числе 11 коров и 42 быков, что соответствует частотам встречаемости соответственно 2,26 и 8,70%. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями инсерции в гене АРОВ, ассоциированной с гаплотипом HCD.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене АРОВ крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом HCD, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота.