Способ моделирования остеопороза на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета у крыс

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.

Согласно литературным источникам на сегодняшний день сахарный диабет является одной из актуальных медико-социальных проблем современного общества. Рост заболеваемости позволяет говорить о глобальной эпидемии сахарного диабета (Javeed N, Matveyenko AV. Circadian Etiology of Type 2 Diabetes Mellitus. Physiology (Bethesda). 2018;33(2):138-150. DOI: 10.1152/physiol.00003.2018; Schmidt AM. Highlighting Diabetes Mellitus: The Epidemic Continues. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018;38(1):e1-e8. DOI: 10.1161/ATVBAHA.117.310221). Широкая распространенность сахарного диабета и многообразие патогенетических вариантов данного заболевания обусловливают актуальность поиска и разработки новых пероральных противодиабетических препаратов.

Одним из закономерно вытекающих осложнений сахарного диабета является постепенное снижение плотности костной ткани, приводящее к развитию остеопороза.

Для изучения патофизиологических изменений, в том числе и остеопороза, у экспериментальных животных на фоне сахарного диабета и поиска инновационных препаратов для лечения осложнений сахарного диабета в лабораторной практике наибольшее распространение получили стрептозотоцин-индуцированные модели СД. (А.А.Спасов, М.П.Воронкова, Г.Л.Снигур, Н.И.Чепляева, В.М.Чепурнова Экспериментальная модель сахарного диабета типа 2. Биомедицина. 2011. №3 С. 12-18).

Недостатком данного решения является то, что моделирование остеопороза на фоне СД требует поддержания гипергликемии в течение длительного времени, а при известных схемах моделирования стрептозотоцин-индуцированного СД происходит выбывание значительной части экспериментальных животных вследствие гибели или выздоровления. При описанной методике введение стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг осуществляется внутрибрюшинно, что протекает с образованием спаечных процессов кишечника ввиду агрессивности среды вводимого вещества и требует предварительного введения никотинамида в дозе 230 мг/кг.

Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа моделирования сахарного диабета у крыс, позволяющего сформировать остеопоротические нарушения в костной ткани с сохранением большего количества животных в эксперименте и получением стабильно высоких цифр гипергликемии на протяжении длительного периода.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ моделирования остеопороза на фоне стрептозотоцин-индуцированного СД, подтверждаемый морфологическими изменениями костной ткани при микроскопии, снижением плотности костной ткани при денситометрии, а также низкой летальностью животных и стабильной гипергликемией.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ моделирования остеопороза на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета, включающий однократное введение стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг внутривенно в хвостовую вену крысам линии Wistar с дальнейшим мониторингом уровня гликемии, затем через 7 дней от первого введения повторное введение стрептозотоцина в дозе 20 мг/кг животным с уровнем гликемии менее 15 ммоль/л, после чего на 57 сутки при помощи аппарата мультиспектральной системы визуализации проводят анализ плотности костной ткани.

Основным преимуществом предлагаемого способа является двухэтапное введение стрептозотоцина, позволяющее снизить летальность у животных с высокой чувствительностью к стрептозотоцину и снизить процент выздоровления у животных с низкой чувствительностью к стрептозотоцину.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Исследование проводилось на 50 самцах крыс линии Wistar массой 200-250 г. Введение стрептозотоцина в 0,1 М цитратном буфере производили натощак в хвостовую вену, после чего в течение 24-48 ч экспериментальным животным заменяли воду на 5 % раствор глюкозы.

Первое введение стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг проводилось всем крысам. Через 7 дней после первого введения животным, имеющим уровень гликемии ниже 15 ммоль/л производили повторное введение стрептозотоцина в дозе 20 мг/кг. В течение эксперимента животные содержались в индивидуальных клетках, ежедневно фиксировались уровень глюкозы крови (Select OneTouch), объем выпитой жидкости и масса потребляемого корма.

На 3 сутки после начала эксперимента количество умерших крыс составило 7. Средняя концентрация глюкозы крови у выживших животных составил 14,1±2,7 ммоль/л. В последующие дни у 10 крыс из 43 наблюдалась тенденция к стойкому увеличению уровня глюкозы (<20 ммоль/л), в то время как у оставшихся уровень гликемии постепенно снижался, доходя до физиологических значений к седьмому дню эксперимента. После повторного введения стрептозотоцина у 51,5 % произошло стойкое повышение уровня глюкозы крови выше 20 ммоль/л, оставшиеся животные были исключены из эксперимента.

В последующие 1,5 месяца эксперимента у 55% животных уровень глюкозы составил от 20 до 33 ммоль/л и у 45% - выше 33 ммоль/л.

Было замечено, что животные, потреблявшие более 150 мл воды за сутки, имели уровень глюкозы крови выше 33,3 ммоль/л. Кроме того, в ходе наблюдений экспериментально был отработан оптимальный режим кормления крыс – 2 раза в день, утром и вечером, что обеспечило стабильно высокий уровень гипергликемии.

У 7 крыс в эксперименте возникло нагноение хвоста в месте инъекции стрептозотоцина, которое наблюдалось на 2-3 неделе наблюдения. Это нагноение интерпретировано как следствие паравазального введения стрептозотоцина и устранено с помощью обработки фукорцином.

На 57-е сутки при помощи аппарата мультиспектральной системы визуализации In-Vivo MS FX PRO производства компании Bruker с программным модулем денситометрии проводили анализ плотности костной ткани. Денситометрию проводили на изъятых и очищенных от окружающих тканей бедренных костях ex vivo. Анализу подвергались три участка бедренной кости: дистальный и проксимальный метафизы и диафиз. Учитывались следующие показатели: «Bone column density» (BCD) – характеризует степень затухания рентгеновского излучения при прохождении через столб длинной трубчатой кости; «Bone Surface Density» (BSD) – плотность поверхности костной ткани в изучаемой локализации. Первичные результаты подвергали статистической обработке в MS Excel с расчетом в группах средних значений и стандартных ошибок; достоверность отличий определяли по t-тесту Стьюдента.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Уровень глюкозы в крови у крыс с моделированием СД начиная с 3-го дня после введения стрептозотоцина достоверно превосходил таковой у интактных животных. При этом уровень гипергликемии нарастал в течение 21 дня, а затем держался на достигнутом уровне (±10%) до конца исследования.

При проведении денситометрии на 57 сутки обнаружили статистически значимое снижение изучаемых показателей плотности костной ткани у крыс с СД по сравнению с интактными животными, кроме того, изучаемые показатели варьировали в зависимости от области исследования.

Так, значения показателя «Bone column density» (BCD) составили у интактных крыс: в проксимальном метафизе – 7,04±0,18г/см³, в диафизе – 8,93±0,05г/см³, в дистальном метафизе – 6,71±0,29г/см³. В то же время значения данного показателя у крыс с СД равнялись 6,11±0,11г/см³, 7,99±0,09г/см³и 5,88±0,25г/см³соответственно (p<0,001). Значения показателя «Bone Surface Density» (BSD) составили у интактных крыс: в проксимальном метафизе – 0,292±0,001г/см², в диафизе – 0,129±0,001г/см², в дистальном метафизе – 0,296±0,02г/см². В то же время значения данного показателя у крыс с СД равнялись 0,22±0,02г/см² (p<0,05), 0,124±0,001г/см² (p>0,05), и 0,225±0,001г/см²соответственно (p<0,05). Результаты денситометрического исследования бедренной кости ex vivo у крыс с 8-недельным сахарным диабетом и интактных животных приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Примечание: * – при р< 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

Таким образом, применение предлагаемого изобретения позволит создавать более эффективный способ моделирования остеопороза на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета, подтверждаемого морфологическими изменениями костной ткани при микроскопии, снижением плотности костной ткани при денситометрии, а также низкой летальностью животных и стабильной гипергликемией.