Тест-система и способ ее получения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к технологии создания тканеинженерных конструкций. Также настоящее изобретение относится к области разработки биологических тест - систем.

Кожа человека является самым большим его органом и защищает организм от широкого спектра внешних воздействий, начиная от ультрафиолетового излучения и механического повреждения, заканчивая защитой от проникновения патогенных микроорганизмов. В коже выделяют три основных слоя - эпидермис, дерма и гиподерма (подкожная жировая ткань) (Montagna W., 2012). Верхний слой -эпидермис отделен от дермы базальной мембраной и представляет собой многослойный эпителий. Так как основная популяция клеток способна синтезировать кератин, то называются эти клетки кератиноциты. Кроме кератиноцитов в эпидермисе также присутствуют меланоциты и клетки Лангерганса (Быков В.Л., 2007).

Меланоциты - клетки-производные нервного гребня, которые синтезируют меланин для защиты внутренних слоев кожи от солнечного ультрафиолетового излучения. Воздействие ультрафиолета (УФ) приводит к фотостарению кожи, что вызывает утолщение и атрофию эпидермального слоя за счет накопления дезорганизованного коллагена и эластина. Фотостарение сопровождается появлением глубоких морщин и пигментных пятен, пожелтением, дряблостью и сухостью кожи, телеангиоэктазией, предопухолевыми поражениями, атрофией, эластозом и актинической пурпурой (Helfrich et al., 2008).

Одним из защитных механизмом кожи против воздействий УФ является активная продукция меланина и перенос его из меланоцитов в кератиноциты с помощью меланосом. Меланин препятствует проникновению УФ в глубокие слои кожи и блокирует выброс АФК. В меланоцитах кожи в основном синтезируется два типа меланина - эумеланин, (черный пигмент) и феомеланин (пигмент красного или желтого типа). Пигментный фенотип кожи в основном определяет рецептор к меланокортину 1 (MCR1). Активация этого рецептора его агонистами α-меланоцит стимулирующим гормоном (αMSH) и адренокортикотропным гормоном (АКТГ) стимулирует меланогенный каскад, приводящий к синтезу эумеланина. Антагонист - сигнальный белок Agouti (ASP) - может обратить описанный процесс и активировать синтез феомеланина (Yamaguchi et al., 2007). Кроме того, интенсивность синтеза меланина в меланоцитах напрямую зависит от количества и активности в клетке фермента тирозиназы, который катализирует два первых этапа образования меланина: гидроксилирование L-тирозина в L-дигидроксифенилаланин (L-DOPA, L-ДОФА) и последующее окисление L-ДОФА в соответствующий хинон - L-дофахинон. Триггером, переключающим дальнейшим синтез, является цистеин: в его присутствии образуется феомеланин, в противном случае - эумеланин (Gillbro et al., 2011).

Таким образом, поддержание постоянной пигментации кожи зависит от множества последовательных процессов: миграции меланобластов в ткань в течение эмбриогенеза, их жизнеспособности и дифференцировки в меланоциты, плотности меланоцитов в коже, структурных компонентов меланом и синтеза различных типов меланина (эу- и феомеланина), созревания и транспортировки меланосом в дендритные отростки меланоцитов и переноса их в кератиноциты, и, наконец, от распределения меланина в супрабазальных слоях кожи (Yamaguchi et al., 2007).

Нарушение любого из этапов регуляции синтеза меланина может привести к потере пигментации, формированию участка кожи измененного цвета, появлению пигментных пятен и опухолей. Основным разрушающим фактором является УФ, который активирует УФ-чувствительные белки (Slominski et al., 2004) и увеличивает экспрессию мастера транскрипционной регуляции пигментации - MITF (Yamaguchi et al., 2007) - основного регулятора процессов, описанных выше. В частности, MITF активирует экспрессию гена TYR (тирозинкиназа), PMEL 17 (или gp100 - белок премеланосом) и Bcl-2 (антиапоптотический фактор), что приводит к повышенному синтезу меланина в отдельных областях кожи (Lin, Fisher, 2007). Прямую регуляцию экспрессии MITF синергически осуществляют транскрипционные факторы Sox 10 и РАХ3 (Hou et al., 2006, Bondurand et al., 2000). После воздействия УФ синтез АФК приводит к нарушение окислительно-восстановительного баланса в меланосомах и переключает синтез с феомеланина на эумеланин (Slominski et al., 2004). То есть, сложный многоэтапный процесс меланогенеза находится под контролем как эндогенных, так и экзогенных факторов.

Поэтому для подавления гиперпигментации и аномального меланогенеза требуется применение комбинированных препаратов, способных оказать воздействие на разных этапах и уровнях регуляции синтеза меланина. Чтобы изучить эффективность и механизмы воздействия комбинированных препаратов требуются новые высокочувствительные, но при этом простые для исполнения методы и модели проведения экспериментальных исследований и их контроля с ограниченным использованием лабораторных животных. В настоящее время для исследования препаратов против гиперпигментации в условиях in vitro используют первичные культуры меланоцитов и кератиноцитов (Lei et al., 2002), а также тканевые эквиваленты, полученные из клеток с индуцированной плюрипотентностью (iPSC) (Gledhill et al., 2015).

Важным аспектом исследования тестируемых препаратов является анализ их канцерогенности. Ранее для исследования развития меланомы и тестирования эффективности противоопухолевых препаратов были предложены 3D культуры (сфероиды) и 2D культуры опухолевых клеток меланомы (Beaumont et al., 2013, Perego et al., 2010). Однако данные изобретения не получили в дальнейшем широкого распространения в связи со сложностью воспроизведения результатов и отсутствием возможности при росте меланомы in vitro предсказать молекулярный или функциональный фенотип раковых клеток (Schatton, Frank, 2010). В отличие от опухолевых клеток, культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов в виде сфероидов обладает стандартными характеристиками в отношении пролиферации и молекулярного фенотипа клеток и может быть применена для исследования причин перерождения клеток кожи человека в стволовые раковые клетки, а также для оценки канцерогенности лекарственных и косметических препаратов. Это связано с тем, что используемые в настоящее время диагностические маркеры меланомы включают в себя изменения в синтезе ключевых белков меланогенеза, таких как MITF, gp100 и Sox10 (Parmiani, 2016, Weinstein et al., 2014), которые с помощью иммуноцитохимического анализа можно быстро выявить in vitro.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения являются коммерческие тканевые эквиваленты «MelanoDerm» (Costin et al., 2013). Тканевые эквиваленты «MelanoDerm» состоят из нормальных человеческих эпидермальных кератиноцитов (NHEK) и меланоцитов (NHM), культивированных с образованием многослойной, высокодифференцированной модели эпидермиса человека. Культура NHM подвергается меланогенезу, приводящему к тканевой пигментации. «MelanoDerm» производится с использованием бессывороточной среды без искусственных стимуляторов меланогенеза, таких как ТРА и IBMX. Тканевые экиваленты выращивают на вставках для тканевой культуры на границе между воздухом и жидкостью, что позволяет местно использовать смягчители кожи или средства самозажигания. Тканевые эквиваленты «MelanoDerm» предназначены для оценки косметических и фармацевтических препаратов, предназначенных для модуляции пигментации кожи in vitro [https://www.mattek.com/products/melanodeirn/].

Недостатком данного изобретения является невозможность проведения длительных исследований с его использованием, что обусловлено структурной нестабильностью тканевых эквивалентов. Другим недостатком данного изобретения является невозможность анализа одного и того же образца тканевого эквивалента некоторыми из методов анализа в динамике, что обусловлено необходимостью проведения разрушающей пробоподготовки образца перед непосредственным анализом. Например, для иммуногистохимического исследования необходимо предварительно получить гистологические срезы тканевого эквивалента, что, очевидно, приводит к его непригодности для дальнейшего анализа данного образца. Фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия невозможна при работе с тканями.

Таким образом, задачей заявленного изобретения является создание тест - системы для оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов, посредством которой было бы возможно проводить длительные исследования и которая, при этом, позволяла бы производить исследования без разрушающей пробоподготовки образцов, а также используя методы анализа, применение которых было невозможно при использовании аналогов.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что тест - система для оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов содержит меланоциты, культивированные-в виде сфероидов.

Клетки, культивированные в виде сфероидов, обладают уникальными характеристиками, приближенными к ткани. Они не пролиферируют, сохраняют тканеспецифичные характеристики молекулярного фенотипа и обладают способностью к длительному выживанию (более месяца) в культуре. Кроме того, размер сфероидов позволяет производить прижизненный анализ экспрессии различных маркеров и получать данные по изменению функциональной активности и других характеристик клеток под влиянием тестируемого препарата в динамике.

В качестве варианта осуществления изобретения, для формирования сфероидов может быть использована первичная или вторичная (после пересева первичной) культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов. Первичная культура может быть выделена из кожи человека с помощью соответствующего протокола выделения [Tsuji, Т. and Karasek, М., 1983. A procedure for the isolation of primary cultures of melanocytes from newborn and adult human skin. Journal of investigative dermatology, 81(2)]. Первичная или вторичная культура клеток должна обладать стандартными характеристиками меланоцитов по отношению к пролиферативной активности и молекулярному фенотипу. Перевиваемые (иммортализованные и/или опухолевые) меланоциты не могут быть использованы в качестве культуры в составе заявленной тест-системы по причине того, что функциональная активность таких клеток отличается от тканеспецифичной активности меланоцитов in vivo.

Используемая культура меланоцитов должна быть проверена на отсутствие контаминирующих агентов: микоплазм, бактерий, грибов и вирусов.

В качестве варианта осуществления изобретения, культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов для формирования сфероидов может быть предварительно заморожена в жидком азоте.

Как вариант, в качестве меланоцитов в составе заявленной тест-системы могут быть использованы культуры НЕМ (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No.: 104-05n, 104-05a) или схожие культуры (спецификация на указанные культуры - в материалах заявки).

При этом в качестве варианта осуществления изобретения, сфероиды могут иметь средний размер в диапазоне 50-200 мкм.

В качестве варианта осуществления изобретения, каждый сфероид состоит из 500-3000 меланоцитов.

Как вариант, меланоциты, культивированные в виде сфероидов, могут быть разделены на опытную и контрольную группу.

Решение поставленной задачи также обеспечивается способом получения заявленной тест-системы, включающий:

A) Суспендирование меланоцитов в полной ростовой среде для культивирования.

Для перевозки культуры меланоцитов чаще всего используется специальная транспортировочная среда, от которой клетки перед вышеуказанной процедурой суспендирования необходимо отмыть, например, путем перенесения культуры меланоцитов в центрифужные пробирки с добавлением раствора Хенкса и последующего осаждения культуры клеток путем центрифугирования в течение 7 мин на 1000об/мин, при 100g с последующим удалением супернатанта. После чего к осадку добавляется полная ростовая среда для культивирования и осуществляется суспендирование клеток.

Б) Высевание культуры меланоцитов на чашки Петри.

Как вариант, клетки могут перенесены в чашки Петри в плотности 10⁴ кл/см².

B) Пассирование культуры с получением культуры меланоцитов 3 пассажа.

Как вариант, пассирование культуры может проводиться с помощью раствора ферментов для отмывки и снятия клеток с поверхности чашки

Как вариант, раствор для отмывки может включать растворы версена и трипсина (0,1-5 мг/л).

Замена полной ростовой среды может производиться, например, каждые двое суток.

Г) Растворение агарозы в базовой ростовой среде с получением раствора агарозы.

Как вариант, навеска агарозы из расчета концентрации 20 г/л растворяется в базовой ростовой среде, в качестве которой на данном этапе может применяться среда DMEM/F12.

Д) Помещение раствора агарозы в пластмассовую форму на 5 минут с получением пластмассовой формы, содержащей полимеризованную агарозу.

Специальные формы для получения агарозных планшетов известны из уровня техники и производятся, например, компанией Micro Tissues®

[https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z764086?lang=en&region=RU]

Е) Выдавливание полимеризованной агарозы из пластмассовой формы в базовую ростовую среду с получением агарозного планшета.

Как вариант, в качестве базовой ростовой среды на данном этапе может применяться среда DMEM/F12.

Ж) Перенесение культуры меланоцитов 3 пассажа на полученный агарозный планшет с получением заявленной тест - системы.

Решение поставленной задачи также обеспечивается способом оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов с использованием заявленной тест - системы, включающим в себя следующие стадии:

- воздействие на заявленную тест - систему;

- измерение уровня функциональной активности меланоцитов в составе заявленной тест

- системы.

- оценка эффекта воздействия путем сравнения уровня функциональной активности меланоцитов в составе заявленной тест - системы, подвергнутых воздействию с уровнем функциональной активности меланоцитов в составе контрольной группы заявленной тест - системы.

При этом воздействием на указанную выше тест - систему может являться как химическое, так и физическое воздействие.

Как вариант, функциональным свойством меланоцитов может являться степень компактизации меланоцитов в составе сфероида. В таком случае измерение осуществляется методом морфометрического анализа по изменению площади проекции сфероида.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень пролиферации. В таком случае измерение осуществляется методом подсчета количества Ki67 - позитивных клеток и/или методом подсчета количества PCNA - позитивных клеток.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень меланина. В таком случае измерение осуществляется методом фотометрического анализа и/или спектрофотометрического анализа. Также измерение может быть проведено методами микроскопии (визуально).

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза фактора созревания меланосом gp100. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза транскрипционного фактора Sox10. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза основного фактора меланогенеза MiTF. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень экспрессии гена рецептора к меланокортину MCR1. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом обратно -транскрипционного ПЦР - анализа, методом ПЦР - анализа в реальном времени.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень экспрессии гена тирозиназы TYR. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом обратно - транскрипционного ПЦР -анализа, методом ПЦР - анализа в реальном времени.

В зависимости от дизайна исследования, меланоциты в составе контрольной группы заявленной тест - системы могут не подвергаться воздействию или подвергаться воздействию, эффект которого на функциональные свойства меланоцитов известен.

На Фиг. 1 представлена динамика формирования сфероидов из суспензии меланоцитов в неадгезивных 3D условиях в стандартной ростовой среде (контроль) и в среде с добавлением препарата Meso-Xanthin F199 в разведении 1:10 (эксперимент). Фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия (Cell-IQ, СМ Technologies, Финляндия).

На Фиг. 2 представлена динамика накопления меланина в сфероидах из меланоцитов в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 (эксперимент), физиологического раствора NaCl (контроль). *р<0,05 в сравнении с отрицательным контролем (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).

На Фиг. 3 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 4 представлены результаты имммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 5 представлены результаты имммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 6 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 7 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 8 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 9 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 10 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 11 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

На Фиг. 12 представлены данные по уровню экспрессии гена MCR1 меланоцитами человека в сфероидах. Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Метод ПЦР в реальном времени, RQ - относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену ТВР. *р<0,05 в сравнении с контрольной группой «Сфероиды + NaCl» (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).

На Фиг. 13 представлены данные по уровню экспрессии гена TYR меланоцитами человека в сфероидах. Приведены средние значения±стандартное отклонение. Метод ПЦР в реальном времени, RQ - относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену ТВР. *р<0,05 в сравнении с контрольной группой «Сфероиды + NaCl» (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).

На Фиг. 14 представлен профиль распределения жизнеспособных и клеток на разных стадиях апоптоза для сфероидов из меланоцитов (А) и тканевых эквивалентов Меланодерм (Б).

На Фиг. 15 представлено процентное соотношение числа живых клеток и клеток в раннем и позднем апоптозе в сфероидах из меланоцитов и тканевом эквиваленте Меланодерм. *р<0,05 при сравнении двух групп (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).

Настоящее изобретение проиллюстрировано далее посредством следующих примеров.

Пример 1. Получение заявленной тест-системы.

Заявленная тест - система получена следующим образом:

На первом этапе культура меланоцитов (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No.: 104-05n) концентрировалась и отмывалась от транспортировочной среды путем перенесения культуры меланоцитов в центрифужные пробирки с добавлением 15 мл раствора Хенкса (Р020п, ПанЭко) и последующего осаждения культуры клеток путем центрифугирования в течение 7 мин на 1000 об/мин, при 100g с последующим удалением супернатанта. Затем проводилось суспендирование осадка культуры меланоцитов в полной ростовой среде для меланоцитов (135-500, CELL Applications, Inc).

На втором этапе производили высевание культуры меланоцитов на чашки Петри в плотности 10⁴ кл/см² с последующим пассированием культуры с помощью раствора для отмывки, содержащем растворы версена и трипсина (0,1 мг/л). Замена полной ростовой среды проводилась каждые двое суток.

Параллельно с вышеуказанным процессом производили подготовку агарозных 3D - планшетов. Для этого агарозу (А6013, Sigma-Aldrich) растворяли в концентрации 20 г/л в базовой ростовой среде DMEM/F12 с получением раствора агарозы. Затем раствор агарозы помещали в пластмассовую форму (3D Petri Dishes, Microtissue, США) на 5 минут с получением пластмассовой формы, содержащей полимеризованную агарозу, которую затем с осторожностью выдавливали из пластмассовой формы в базовую ростовую среду DMEM/F12 с получением агарозного планшета.

На последнем этапе культуру меланоцитов 3 пассажа переносили на полученный агарозный планшет с получением заявленной тест - системы.

Пример 2. Оценка эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов посредством заявленной тест - системы.

Для изучения влияния препарата Meso-Xanthin F199 на функциональную активность меланоцитов в условиях, приближенных к нативной ткани, была использована тест - система, содержащая меланоциты, культивированные в виде сфероидов.

Материалы и методы

Для исследования использовали аликвоты коммерческого препарата Meso-Xanthin F199, смешанные с полной ростовой средой в соотношении 1:10 (по объему). В качестве отрицательного контроля использовали эквивалентное количество физиологического раствора NaCl.

3D культивирование меланоцитов человека

Для изучения влияния Meso-Xanthin F199 на накопление меланина меланоцитами в условиях, приближенных к нативной ткани, суспензию культуры клеток 3 пассажа с добавлением препарата и без него помещали на неадгезивные агарозные планшеты.

Агарозные планшеты получали за счет полимеризации агарозы в специальных пластмассовых формах (3D Petri Dishes, Microtissue, США).

Для данного этапа исследования использовали аликвоты Meso-Xanthin F199, смешанные с полной ростовой средой в соотношении объемов 1:10. В качестве негативного контроля использовали эквивалентное количество физиологического раствора NaCl. Осадок меланоцитов ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1×10³ клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ («СМ Technologies)), Финляндия) с фоторегистрацией каждые 20 минут.Полученные сфероиды фиксировали на 1, 3 и 7 сутки.

Фиксация тканевых эквивалентов Меланодерм и сфероидов из меланоцитов человека

Перед фиксацией 3D культуры, сфероиды собирали в общую пробирку типа эппендорф с помощью наконечника до 1000 мкл. Далее сфероиды осаждали с помощью центрифугирования (1 мин, 600 об/мин, 600 g), супернатант сливали и добавляли к осажденным сфероидам раствор фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Данную операцию повторяли еще два раза. После третьего центрифугирования к сфероидам добавляли 4%-ный раствор параформальдегида, в котором сфероиды фиксировали 20 мин при +4°С.

Иммуноцитохимический анализ

Сфероиды перед окрашиванием помещали на полилизиновые предметные стекла. После предварительной подготовки срезы и сфероиды инкубировали с первичными антителами к антигенам gp 100 (ab 137078, Abeam), Sox10 (ab 155279, Abeam), MiTF (ab 122982, Abeam), а также Ki-67 (ab 15580, Abeam). Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (Е=525 нм) и DyLight594 (Е=617 нм). Ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид - Hoechst 33258 (0,002 мг/мл, 10 минут, 25°С). После окрашивания избыток красителя удаляли троекратной сменой фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Полученные препараты заключали в монтирующую среду витрогель (12-001, Биовитрум) и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 («Olympus», Япония).

Фотометрический анализ концентрации меланина в сфероидах из меланоцитов человека.

Перед фотометрическим анализом сфероиды отмывали от остатков среды троекратной сменой фосфатно-солевого буфера (рН=7,4) и хранили при температуре минус 20°С. Для экстракции меланина образцы размораживали, высушивали, и к каждому образцу добавляли 250 мкл лизирующего раствора Solvable (6NE9100, PerkinElmer), после чего образцы инкубировали в течение 18 часов на водяной бане при +60°С. После инкубации, образцы тщательно перемешивали на вортексе, осаждали нерастворенные частицы с помощью центрифугирования (5 мин, 13000 об/мин), супернатант разделяли по 100 мкл, вносили в 96-луночный планшет и анализировали оптическую плотность на планшетном фотометре Multiscan GO (Thermo Scientific, США). Калибровочную кривую получали при анализе стандартных растворов с известной концентрацией меланина, приготовленных из сухого вещества (М863, Sigma-Aldrich).

Анализ экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Тотальную РНК выделяли, используя TRIReagent (Sigma, США) и ДНКазу I типа (Fermentas, Германия), осаждали в 4М LiCl, ее концентрацию измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). С использованием обратной транскриптазы M-MLV (Евроген, Россия) и рандомных гексануклеотидов (Силекс, Россия) проводили синтез кДНК. На полученных образцах анализировали экспрессию гена рецептора 1 к меланокортину (MCR1), гена тирозиназы (TYR). В качестве референсного гена, относительно которого измеряли количественное изменение анализируемых генов, использовали ген ТВР. Анализ проводили с помощью праймеров:

Анализ проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием смеси qPCRmix-HSSYBR+ROX (Евроген, Россия). Расчет относительной экспрессии гена выполняли методом ΔΔCt с учетом эффективности реакции, определенной методом построения стандартных кривых (Bookout et al., 2006).

Статистический анализ данных

Исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. С использованием критериев Шапиро-Вилка и χ2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Крускалла-Уоллиса.

Результаты

Формирование сфероидов из меланоцитов человека в 3D культуре и динамика накопления в них меланина в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 и без него

Клетки третьего пассажа помещали на неадгезивные агарозные планшеты с лунками диаметром 400 мкм для получения 3D культуры - сфероидов. С использованием метода прижизненной цейтраферной микроскопии на приборе Cell IQ (CM Tecnologies, Финляндия) наблюдали динамику формирования сфероидов из меланоцитов в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 и без него (Фиг. 1).

В процессе культивирования клеток в 3D условиях наблюдали общие закономерности процесса формирования сфероидов - первоначальная компактизация происходила уже в первые сутки культивирования, процесс компактизации (уплотнения) сфероидов продолжался до 7 суток. Визуальная оценка клеток в сфероиде показала, что в сфероидах контрольной группы (в ростовой среде без добавления препарата) происходило более быстрое и значительное накопление меланина в клетках центральной зоны сфероидов. Сфероиды экспериментальной группы (с добавлением препарата Meso-Xanthin F199) к седьмым суткам культивирования были более светлыми и более компактными.

Данные спектрофотометрии подтвердили результаты визуальной оценки интенсивности синтеза меланина в контрольных и экспериментальных сфероидах. Как показано на Фиг. 2, если на 1 сутки 3D культивирования средняя концентрация меланина была схожа в обеих группах, то при дальнейшем 3D культивировании - на 3 и 7 сутки, синтез меланина сфероидами в экспериментальной группе в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 в разведении 1:10 незначительно повышался, тогда как в группе контроля наблюдали значительное и достоверно значимое увеличение синтеза меланина в процессе культивирования.

Иммуноцитохимический анализ меланосфероидов контрольной и экспериментальной групп

При анализе экспрессии транскрипционных факторов меланогенеза, было установлено, что в контрольной группе экспрессия gp100 (Фиг. 3-5), как и транскрипционного фактора MITF (Фиг. 6-8) увеличивалась уже к 3 суткам культивирования, достигая максимума к 7 суткам культивирования. В сфероидах экспериментальной группы экспрессию gp100 и MITF на протяжении всего периода культивирования наблюдали только в отдельных клетках. Фактор Sox 10 экспрессировался в сфероидах обеих групп, уровень его экспрессии увеличивался по мере культивирования (Фиг. 9-11).

Исследование экспрессии генов MCR1 и TYR меланоцитами человека в сфероидах в контроле и эксперименте

Исследование сфероидов показало снижение экспрессии гена MCR1 на 3 сутки культивирования в присутствии препарата Meso-Xanthin F199. К 7 суткам культивирования экспрессия MCR1 достигала своего минимального значения в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой, к которой добавляли физиологический раствор (NaCl) (Фиг. 12). При этом экспрессия гена в группе контроля с NaCl колебалась на протяжении всего периода культивирования, возрастая к 3 суткам и незначительно снижаясь к 7 суткам.

В ходе анализа экспрессии гена TYR наблюдали практически полное подавление его синтеза на 7 сутки в эксперименте с добавлением Meso-Xanthin F199, тогда как в контроле с NaCl экспрессия гена сохранялась примерно на одном уровне в течение всего срока 3D культивирования (Фиг. 13).

Вывод

В ходе исследования Meso-Xanthin F199 проявил себя как препарат с высокой биологической активностью. Полученные результаты свидетельствуют о возможности положительного влияния анализируемого препарата на защитные свойства кожи человека.

На примененной в исследовании тест - системе, содержащей меланоциты, культивированные в виде сфероидов, показано, что препарат Meso-Xanthin F199 способен подавлять синтез меланина, в итоге понижая его концентрацию в ткани. После проведенного иммуноцитохимического анализа, было установлено, что Meso-Xanthin F199 влияет, в первую очередь, на экспрессию фактора созревания меланосом gp100 и, в меньшей степени, воздействует на экспрессию мастера транскрипции регуляции пигментации MITF и транскрипционный фактор Sox 10. При анализе экспрессии генов MCR1 и TYR было установлено, что Meso-Xanthin F199 способен подавлять экспрессию обоих генов, преимущественно гена тирозиназы. При этом максимальное воздействие инъекционного препарата достигается к последнему дню культивирования in vitro, что свидетельствует о накопительном эффекте.

Полученные данные свидетельствуют об избирательности воздействия исследуемого инъекционного препарата - он подавляет созревание меланосом и интенсивный синтез меланина, однако не блокирует основные пути меланогенеза, следовательно, не способен вызвать тяжелые патофизиологические осложнения. Таким образом, препарат Meso-Xanthin F199 является высокоэффективным против гиперпигментации.

Также полученные данные позволяют сделать вывод о том, что заявленная тест -система позволяет производить оценку эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов.

Пример 2. Анализ жизнеспособности клеток в тканевых эквивалентах.

Материалы и методы

Исследование было проведено на тканевых эквивалентах Меланодерм (MEL-300, MatTek Corporation) и заявленной тест-системе, представляющей собой меланоциты, культивированные в виде сфероидов.

Культивирование тканевых эквивалентов Меланодерм

Набор тканевых эквивалентов, содержащий 24 образца, был транспортирован в лабораторию при температурном режиме +4°С, после чего образцы, расположенные в специальных держателях, были перенесены в культуральные шестилуночные планшеты в индивидуальные лунки. Каждый образец был помещен на подставку (MEL-STND, MatTek Corporation) на границу между водной и воздушной средами. Тканевые эквиваленты культивировали в полной ростовой среде, предоставляемой компанией вместе с образцами (EPI-100-NMM-113, MatTek Corporation) в стандартных условиях (370С, 5% CO2), замену среды производили ежедневно. Анализ жизнеспособности клеток в тканевом эквиваленте производили на 14 сутки 3D культивирования.

3D культивирование меланоцитов человека

Для изучения жизнеспособности меланоцитов в условиях, приближенных к нативной ткани, монослойные культуры клеток 3 пассажа с добавлением препарата и без него помещали на неадгезивные агарозные планшеты. Агарозные планшеты получали за счет полимеризации агарозы в специальных пластмассовых формах (3D Petri Dishes, Microtissue, США).

Для этого культуру, достигшую конфлюэнтного состояния, диссоциировали с помощью раствора версена (Р080п, ПанЭко) и 0,25% раствора трипсина (Р036п, ПанЭко), полученную суспензию клеток помещали в центрифужные пробирки объемом 15 мл. Действие трипсина инактивировали добавлением 500 мкл сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone), далее суспензию клеток осаждали с помощью центрифугирования (100 g, 1000 об/мин, 7 минут). Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1×10³ клеток в лунку, где они формировали сфероиды. Замену полной ростовой среды производили каждые двое суток. Анализ жизнеспособности клеток производили на 14 сутки 3D культивирования.

Анализ жизнеспособности клеток в сфероидах и тканевых эквивалентах Меланодерм Полученные сфероиды и тканевые эквиваленты Меланодерм на 14 сутки культивирования помещали в центрифужные пробирки объемом 15 мл и диссоциировали до суспензии клеток с помощью раствора версена (Р080п, ПанЭко) и 0,25% раствора трипсина (Р036п, ПанЭко). Далее действие трипсина инактивировали добавлением к каждому образцу 500 мкл сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone), после чего полученные суспензии клеток осаждали с помощью центрифугирования (100 g, 1000 об/мин, 7 минут). Осадок каждого образца ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (рН=7,4), содержащего 1% сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone). Далее, в соответствии с протоколом анализа от каждого образца отбирали пробу объемом 100 мкл и инкубировали со 100 мкл реагента для анализа апоптоза Аннексии V + мертвые клетки (МСН100105, Merck) в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью клеточного анализатора Muse (Merck). Всего было исследовано три образца сфероидов (по 256 сфероидов в каждом образце) и три образца тканевых эквивалентов Меланодерм.

Результаты

В ходе анализа жизнеспособности профиль распределения живых клеток и клеток в апоптозе (Фиг. 14) показал, что большая часть клеток в тканевых эквивалентах Меланодерм находились на стадии позднего апоптоза, в отличие от сфероидов из меланоцитов, представленных преимущественно живыми клетками. Среднее количество живых клеток в сфероидах превышало 85%, тогда как количество живых клеток в тканевых эквивалентах составляло не более 10% (данные приведены в Таблице 1).

Значимые различия были установлены только при сравнении числа жизнеспособных клеток и клеток в позднем апоптозе, количество клеток в раннем апоптозе в сфероидах и эквивалентах было одинаковым (Фиг. 15).

Таким образом, к 14 суткам культивирования сфероиды из меланоцитов, в отличие от тканевых эквивалентов Меланодерм, сохраняли высокую жизнеспособность клеток и, следовательно, являются более предпочтительной тест-системой для долгосрочных исследований.