МЕТОД ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕДЕЛА УСТОЙЧИВОСТИ ЖИВОТНЫХ К ТЯЖЕЛОЙ ГИПОКСИИ ПОСЛЕ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ

Изобретение относится к экспериментальной биологии, а именно к экспериментальной нейробиологии, и может быть использовано для предикции предела устойчивости к тяжелой гипоксии животных, предварительно адаптированных к кратковременным не повреждающим гипоксическим или ишемическим (прекондиционирующим) воздействиям, и изучения молекулярных (генетических и претеомных) и биохимических механизмов гипоксического/ишемического прекондиционирования.

Известен биохимический способ оценки устойчивости животных к гипоксии с помощью анализа содержания АМФ мозга. Данный способ может быть применен для оценки эффективности гипоксического тренинга, степень воздействия на организм которого определяют по снижению содержания АМФ мозга относительно нормы («Молекулярные аспекты адаптации к гипоксии», Наукова Думка, 1979 г., с. 98-107). Недостатком известного способа является то, что оценку устойчивости животного к гипоксии производят путем изучения внутриклеточного содержания одного из метаболитов энергетического обмена, что возможно только предварительно убив животное, т.е. данный способ не обладает свойствами предиктора.

Наиболее близким к изобретению является метод оценки предела устойчивости животных к гипоксии путем измерения времени их «выживания» до момента наступления признаков агонии (Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2009 г., т. 147, №4, с. 380-384). При использовании данного метода индивидуальные результаты, полученные при оценке устойчивости, не позволяют прогнозировать величину этого показателя после прекондиционирующего воздействия. Более того, данные этого способа могут не только не подтверждать положительный эффект тренинга, но свидетельствовать о снижении устойчивости животных к тяжелой гипоксии (Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2011 г., т. 151, №2, с. 140-144). Поэтому данный способ не может быть использован в качестве предиктора устойчивости животных к тяжелой гипоксии после гипоксического прекондиционирования.

Техническим результатом, которого можно достичь при осуществлении изобретения, является разработка гуманного нестрессирующего и безопасного способа предикции устойчивости организма животных к тяжелой гипоксии после гипоксического прекондиционирования, который в перспективе можно было бы применить на людях.

Технический результат достигается за счет того, что согласно методу прогнозирования предела устойчивости животных к тяжелой гипоксии после гипоксического прекондиционирования интактных животных исследуют в модели поведенческого теста предстимульного торможения акустической стартл-реакции, определяя относительную величину снижения амплитуды индивидуальной реакции на интенсивный звуковой сигнал (ПСТ), затем их подвергают умеренному гипоксическому прекондиционированию, после чего по значению ПСТ определяют величину предела устойчивости их организма к тяжелой гипоксии (Тсек), используя ранее выявленную эталонную корреляционную зависимость Тсек = f(ПСТ), для получения которой у интактных животных того же вида определяют аналогичным образом ПСТ, затем их подвергают аналогичному умеренному гипоксическому прекондиционированию, после которого животных помещают в условия тяжелой гипоксии и определяют величины предела их устойчивости к ней по времени до наступления признаков агонии, после чего производят статическую обработку результатов.

В проанализированных патентных источниках информации не обнаружено сведений об использовании гипоксического прекондиционирования и поведенческого теста предстимульного торможения акустической стартл-реакции (ранее применявшегося как в экспериментальных исследованиях, так и медицинской практике) для предикции предела устойчивости животных к тяжелой гипоксии после гипоксического прекондиционирования, что позволяет сделать вывод о соответствии данного способа критериям охраноспособности «изобретательский уровень» и «новизна».

Поведенческая модель предстимульного торможения акустической стартл-реакции (согласно данному способу исследований) может быть применена на любых экспериментальных видах/линиях животных.

Экспериментально установлено, что индивидуальные показатели поведенческого теста (относительной величины снижения амплитуды индивидуальной реакции на интенсивный звуковой сигнал - ПСТ) однозначно коррелируют с показателями степени устойчивости к тяжелой гипоксии (Тсек) после однократного умеренного гипоксического воздействия, т.е. Тсек = f(ПСТ).

Способ осуществляют следующим образом.

В начале исследований выявляют эталонную корреляционную зависимость величины предела устойчивости организма интактных животных (крыс) к тяжелой гипоксии (Тсек) от относительной величины снижения амплитуды индивидуальной реакции на интенсивный звуковой сигнал (ПСТ), полученной в результате их тестирования в модели поведенческого теста предстимульного торможения АСР, т.е. определяют Тсек = f(ПСТ). Для этого проводят следующие этапы исследований.

1. Проводят тестирование в поведенческой модели предстимульного торможения акустической стартл-реакции (Neuroreport, 1998, V. 9, №3, р. 461-466).

Для этого контрольную группу крыс помещают в камеру для тестирования, оснащенную тензодатчиком с самописцем и компьютером для фиксирования амплитуды стартл-реакции. В качестве основного стимула (звукового сигнала) используют широкополосный шум длительностью 100 мс и громкостью 110 ДБ, в качестве предстимула - сигнал длительностью 40 мс и громкостью 85 ДБ. В ходе тестирования крысам предъявляют 2 основных стимула, затем, в случайном порядке, 5 основных стимулов в сочетании с предстимулом (с интервалом 120 мс) и 5 основных стимулов без предстимула (с интервалом порядка 15 мс). Величину ПСТ оценивают по формуле (А₀-А_п)/А₀, где А₀ - средняя амплитуда реакции в пробах без предстимула (исключая первые две пробы), а А_п - средняя реакция в пробах с предстимулом.

2. Через 5-6 дней после тестирования крыс подвергают умеренному тренировочному воздействию в барокамере, герметично закрытой крышкой с двумя отводами, один из которых предназначен для отвода воздуха, а второй - для соединения с барометром. Крыс в барокамере «поднимают» на высоту 5000 м со скоростью 50 м/с и выдерживают там 60 мин.

3. Через 4 мин реоксигенации крыс повторно помещают в барокамеру и вторично подвергают гипоксическому воздействию, но уже тяжелому - на высоте 11500 м (эквивалентно 4% О₂) при той же скорости подъема. Устойчивость к тяжелой гипоксии оценивают по времени от момента достижения критической высоты 11500 м до наступления агонии (атональный вдох в сочетании с выраженным падением мышечного тонуса).

4. Производят статическую обработку результатов тестирования, используя корреляционный анализ Пирсона.

5. На основании полученных результатов получают зависимость Тсек = f(ПСТ).

6. В соответствии с полученной зависимостью можно с высокой степенью достоверности оценить пределы устойчивости к тяжелой гипоксии после сеанса гипоксического прекондиционирования исследуемых животных того же вида и ранжировать их в соответствии с полученными результатами.

Для этого требуется предварительно протестировать интактных животных в модели поведенческого теста предстимульного торможения акустической стартл-реакции, определив их ПСТ, а затем подвергнуть умеренному гипоксическому тренингу, после чего по значению ПСТ можно вынести суждение о величине предела устойчивости организма к тяжелой гипоксии (Тсек), используя ранее выявленную корреляционную зависимость.

Способ исследования индивидуальной зависимости Тсек = f(ПСТ) опробован на 19 белых беспородных крысах-самцах весом 220-250 г. Результаты исследований иллюстрируются примерами.

Пример 1.

1. Результаты тестирования первой группы крыс (n=10 особей) в модели ПСТ показали значения ПСТ от +0,063 до +0,876 (табл. 1).

2. После тестирования крысы отдыхали в стандартных условиях вивария 5-6 дней.

3. После отдыха крыс подвергали сеансу гипоксического прекондиционирования.

4. Через 4 мин после сеанса крыс поместили в условия тяжелой гипоксии и оценили их устойчивость Τ (табл. 1).

5. Определили зависимость между показателями ПСТ и Т, используя корреляционный анализ Пирсона.

Пример 2.

1. Результаты тестирования второй группы крыс (n=9 особей) в модели ПСТ показали значения ПСТ от -0,1217 до +0,7113 (табл. 2).

2-4. - такие же, как в примере 1. Результаты исследования устойчивости к тяжелой гипоксии по п. 4 приведены в табл. 2.

5. Корреляционный анализ Пирсона показал достоверную корреляцию между исследуемыми показателями (табл. 2) за исключением одной цифры, а именно, крыса №8 после тренинга проявила значительно более высокую устойчивость, чем это ожидалось по опробированию первой группы.

Объединив данные обеих групп, включая исключение, получена достоверная корреляция между ПСТ и Τ (коэффициент корреляции Пирсона r=-0,548, значение вероятности ρ<0,02, при n=19). По результатам двух исследований построен график полученных результатов исследования (ломаные тонкие линии соответственно номерам животных) и аппроксимирующая их кривая Тсек = f(ПСТ) (жирная линия), на которой обозначился гарантированный нижний предел устойчивости всех исследуемых крыс после гипокситренинга в зависимости от ПСТ (Фиг. 1). Этот нижний предел устойчивости использовался далее для исследования беспородных белых крыс.

Таким образом, предварительное тестирование в поведенческой модели предстимульного торможения акустической стартл-реакции с использованием экспериментально полученного графика позволяет исследовать и ранжировать исследуемых животных на группы по возможной устойчивости к тяжелой гипоксии и, следовательно, прогнозировать эффективность прекондиционирующего воздействия, получая возможность исследования механизмов, лежащих в основе ее различий, и поиска путей повышения устойчивости к гипоксическим нагрузкам организма.

Гуманный и безопасный способ предикции предела устойчивости животных к тяжелой гипоксии после гипоксического прекондиционирования может найти широкое применение в экспериментальной нейробиологии при изучении механизмов гипоксического тренинга на организм.