СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОСУДОРОЖНОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТИКОЛИНА И ВАЛЬПРОАТА НАТРИЯ ПРИ ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИМЕНЕНИИ НА МОДЕЛИ ОСТРЫХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ СУДОРОГ, ВЫЗВАННЫХ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОМ У КРЫС САМЦОВ ЛИНИИ ВИСТАР

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохимии, патофизиологии, неврологии и психиатрии. Оно связано с повышением эффективности лечения эпилепсии. Эпилепсия - сложное по этиологии и патогенезу нервно-психическое заболевание - имеет хронически-прогредиентное течение и характеризуется полиморфностью как пароксизмальных проявлений, так и нарушений психической деятельности. С одной стороны, классические и новые противоэпилептические лекарственные средства могут купировать повышенную судорожную активность мозга, но, как правило, не обладают защитными свойствами в отношении нейродегенерации [1]. Таким образом, проблема предотвращения повреждения головного мозга в результате судорог остается нерешенной. С другой стороны, действие большинства противоэпилептических препаратов сопровождается рядом побочных эффектов, к числу которых можно отнести нарушение основных когнитивных функций - внимания, памяти, восприятия и др. [5, 7, 10]. В связи с изложенным представлялось целесообразным исследовать влияние цитиколина (аналога эндогенного цитиколина, который в настоящее время широко применяется в лечении когнитивных, чувствительных, двигательных неврологических нарушений дегенеративной и сосудистой этиологии, и обладает нейрорегенеративными и нейропротективными свойствами) [6, 8, 9, 11, 12] и вальпроата натрия - противосудорожного медикаментозного препарата [2, 3, 4].

Известен способ предупреждения нейродегенерации нейронов у животных с помощью пирацетама в условиях ПТЗ-киндлинга [11]. Известно, что пирацетам - это ноотропное средство, которое повышает устойчивость мозга к гипоксии, интегративной работе, положительно влияет на процессы памяти и обучения, улучшает кровообращение головного мозга и не оказывает седативного действия. В условиях ПТЗ-киндлинга у мышей показано, что применение пирацетама ведет к превенции нейрональных повреждений и снижении дефицита ранее полученных навыков при обучении у животных.

Недостатком данного способа является отсутствие оценки противосудорожного действия пирацетама в условиях острых генерализованных судорог, вызванных пентилентетразолом,

В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран способ усиления препаратом ноопепт противосудорожной активности вальпроата у мышей. Ноопепт - оригинальный дипептидный препарат, обладающего ноотропной, нейропротекторной и анксиолитической активностью. В данном способе на модели судорог, вызванных коразолом у мышей, ноопепт (0,5 мг/кг внутрибрюшинно) ни при однократном, ни при повторном воздействии (10 или 35 дней) не усиливал судорожный эффект коразола, что позволяет предполагать отсутствие у препарата проконвульсивных свойств [3]. Это составляет преимущество ноопепта перед пирацетамом, который усиливает судорожную готовность. При длительном (5-недельном) предварительном воздействии ноопепт усиливал противосудорожный эффект вальпроата. Проведенное исследование может служить экспериментальным обоснованием целесообразности курсового применения ноопепта совместно с вальпроатом с целью усиления противосудорожных свойств последнего, а также благоприятного влияния на когнитивные функции и замедления прогрессирования нейродегенеративных процессов.

Недостатком данного способа является необходимость длительного пятинедельного воздействия ноопепта для усиления противосудорожного эффекта вальпроата, а также то, что применение ноопепта и вальпроата не уменьшает их доз при сочетанном применении для получения противосудорожного эффекта.

Задачей изобретения является разработка способа, который позволяет выявить противосудорожную активность цитиколина и вальпроата натрия натрия в условиях острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ у крыс самцов линии Вистар.

Поставленная задача решается благодаря тому, что способ выявления противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении предусматривает следующие отличия: было проведено 3 серии опытов с целью достоверной оценки спектра и степени противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия. Препараты вводили опытным животным внутрибрюшинно с таким расчетом, чтобы пик их действия совпадал: цитиколин вводили в дозе 300 мг/кг за 1 час до тестирования ПТЗ, а, вальпроат натрия в дозе 70 мг/кг за 10 минут до тестирования ПТЗ. Сущность предложенного способа заключалась в том, что при сочетанном применении цитиколина и вальпроата в минимально действующих дозах на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, эффект обоих препаратов усиливался. Латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог достоверно увеличились на 66,70% и 63,36% соответственно по сравнению с группой контрольных животных, а у 12,5% наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог опытных животных. У данных крыс в условиях острых генерализованных судорог, вызванных ПТЗ, противосудорожный эффект цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении был более выражен.

Между совокупностью существенных признаков заявленного объекта и достигнутыми техническими результатами существует причинно-следственная связь: совместное введения цитиколина и вальпроата натрия расширяет их спектр и увеличивает степень их противосудорожного действия у крыс линии Вистар на фоне острых пентилентетразоловых судорог.

Новыми признаками заявленного способа выявления противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, у крыс самцов линии Вистар является:

1. Наличие противосудорожного действия после однократного введения цитиколина в дозе 500 мг/кг за один час до введения ПТЗ, отмечалось повышение судорожных порогов: тяжесть судорог была ниже на 33,18%, продолжительность жизни животных увеличилась в 3,26 раза.

2. Проявление противосудорожного действия вальпроата натрия в дозе 100 мг/кг 10 минут до введения ПТЗ приводило к снижению на 50,7% тяжести судорог и предотвращало гибель животных.

3. При сочетанном применении цитиколина в дозе 300 мг/кг и вальпроата натрия в дозе 70 мг/кг при их совместном применении (цитиколина за час до введения ПТЗ, и вальпроата натрия за 10 минут до введения ПТЗ) достоверно латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог увеличились на 66,70% и 63,36% соответственно по сравнению с группой контрольных животных, а у 12,5% наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог опытных животных.

Способ разработан на основе следующих экспериментов.

1. Методика экспериментов.

Эксперименты выполнены на крысах самцах линии Вистар (n=116) массой 160-190 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пищи. Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ №267 от 19.06.2003 г.

Изучение эффективности сочетанного применения вальпроата натрия и цитиколина проводили на модели острых генерализованных судорог, вызванных внутрибрюшинным введением ПТЗ в дозе 70 мг/кг. Определяли латентные периоды первых судорожных проявлений, клонической и тонической фаз (падение животного на бок) генерализованной судорожной реакции, длительность этих фаз, тяжесть судорожной реакции, продолжительность жизни и летальность. Тяжесть судорожной реакции оценивали в баллах: 1 - миоклонические вздрагивания; 2 - клонические судороги передних конечностей (поза «кенгуру»); 3 - повторные клонические судороги; 4 - тонико-клонические судороги с падением животного на бок; 5 - повторные тонико-клонические судороги и/или гибель животного.

Проведено 3 серий опытов. В 1-й и во 2-й сериях определяли минимальное противосудорожное действие цитиколина (Цераксон, «Nicomed Ferrer Internacional, S.A.») и вальпроата натрия (Конвулекс) (Convulex, «Gerot Pharmazeutika GmbH») на острые генерализованные судороги. С этой целью цитиколин вводили внутрибрюшинно в дозах 300, 500 мг/кг за 1 час до введения ПТЗ, а вальпроат натрия - в дозах 70 и 100 мг/кг за 10 мин до введения ПТЗ. В 3-й серии исследовали эффективность сочетанного применения цитиколина и вальпроата натрия в минимально действующих противосудорожных дозах на острые генерализованные судороги у животных. Во всех сериях контролем служили животные, которым вводили физиологический раствор в аналогичных условиях опыта.

2. У контрольных животных во всех сериях опытов введение ПТЗ приводило к развитию генерализованной эпилептической активности: через 43-50 с появлялись первые судорожные проявления в виде вздрагивания головы или отдельных мышц туловища, которые переходили в клонические вздрагивания всего тела. Затем через 52-57 секунд следовали клонические судороги передних конечностей с подъемом животного на задние лапы (поза «кенгуру»). Завершались судороги тонико-клоническим припадком с падением животного на бок и фазой постприступной депрессии. Тяжесть судорог у животных в среднем составила 4,33-4,53 балла, а летальность - 53-87%.

В 1-й серии опытов введение цитиколина в дозе 500 мг/кг оказывало противосудорожное действие, которое выражалось в увеличении на 42,09% латентного периода первых судорожных проявлений и на 47,43% клонических судорог по сравнению с группой контрольных животных. Тяжесть судорог была ниже на 33,18%. Продолжительность жизни животных увеличивалась в 3,26 раза. Число погибших животных было на 80,61% ниже, чем в контрольной группе. Введение цитиколина в дозе 300 мг/кг вызывало у животных только увеличение латентного периода наступления тонических судорог и не влияло на другие показатели судорожной активности по сравнению с группой контрольных животных.

Во 2-й серии опытов противосудорожное действие вальпроата натрия в дозе 100 мг/кг выражалось в снижении на 50,77% тяжести судорог и предотвращении гибели животных. Доза вальпроата натрия 70 мг/кг оказалась менее эффективной: тяжесть судорог была ниже на 24,25%, а летальность - на 46,42% по сравнению с группой контрольных животных.

Таким образом, цитиколин и вальпроат натрия в дозах 300 и 70 мг/кг по-отдельности оказывали менее выраженное противосудорожное действие и были выбраны для проведения дальнейшего исследования.

В 3-й серии опытов сочетанное применение вальпроата натрия в дозе 70 мг/кг и цитиколина в дозе 300 мг/кг привело к усилению противосудорожных свойств обоих препаратов. Так, латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог увеличились на 66,70 и 63,36%, соответственно, по сравнению с группой контрольных животных. У 12,5% опытных животных наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог.

Таким образом, изобретение позволяет выявить как спектр противосудорожного действия сочетанного применения цитиколина и вальпроата натрия так и степень их выраженного противосудорожного действия у животных на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, что связано с усилением противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совестном применении.

Литература

1. Киссин М.Я. Клиническая эпилептология - М.: ГЭОТАР-Медия, 2009. - 256 с.

2. Карпова М.Н., Зиньковский К.А., Кузнецова Л.В., Клишина Н.В. Повышение порогов судорожной реакции после введения цитиколина мышам линии С57В1/6 // Бюл. экспер. биол. и мед. 2014. Т. 158, №9. С. 296-298.

3. Кравченко Е.В., Понтелеева И.В., Трофимов С.С. и др. Оригинальный ноотропный и нейропротекторный препарат ноопепт усиливает противосудорожную активность вальпроат натрия (конвулекс) а у мышей // Экспер. и клин. фармакол. 2009. Т. 72, №6. С. 15-17.

4. Кузнецова Л.В., Карпова М.Н., Зиньковский К.А., Клишина Н.Ю. Влияние цитиколина на развитие хронической эпилептизации мозга (пентилентетразолового киндлинга) и острую судорожную реакцию мышей С57В1/6, подвергшихся киндлингу // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 2014. №.3. С.3-9.

5. Малинин Д.И. Побочное действие психотропных средств. М., 2000.

6. J., G.С. The Role of Citicoline in Neuroprotection and Neurorepair in Ischemic Stroke // Brain Sci. 2013. Vol. 3, N 3. P. 1395-1414.

7. Fritz N., Glogau S., Hoffmann J. et al. Efficacy and cognitive side effects of tiagabine and topiramate in patients with epilepsy // Epilepsy Behav. 2005. Vol. 6, N3. P. 373-381.

8. Hurtado O., Lizasoain I., Moro Neuroprotection and recovery: recent data at the bench on citicoline // Stroke. 2011. Vol. 42, N 1. Suppl. P.

9. Hurtado О., Moro M.A., Cardenas A. et al. Neuroprotection afforded by prior citicoline administration in experimental brain ischemia: effects on glutamate transport // Neurobiol. Dis. 2005. Vol. 18. N 2. P. 336-345.

10. Meador K.J., Loring D.W., Moore E.E. et al. Comparative cognitive effects of phenobarbital, phenytoin, and valproate in healthy adults // Neurology. 1995. Vol. 45, N8. P. 1494-1499.

11. Pohle W., Becker A., Grecksch G. et al. «Piracetam prevents pentylenetetrazol kindling-unduced neuronal loss and learning defcits // Seizure. 1997. V. 6 P. 467-474.

11. Saver J.L. Citicoline: update on a promising and widely available agent for neuroprotection and neurorepair // Rev. Neurol. Dis. 2008. Vol. 5, P. 167-177.

12. Secades J.J. Probably role of citicoline instroke rehabilitation: review of literature // Rev. Neurol. 2012. Vol. 54, P. 173-179;