Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциальной диагностики бляшечного псориаза с другими хроническими заболеваниями кожи

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может найти свое применение в медицинских целях для дифференциальной диагностики бляшечного псориаза и других хронических заболеваний кожи.

Для дифференциальной диагностики в сложных случаях прибегают к гистологическому методу исследования. Гистологические изменения кожи при псориазе характеризуются псориазиформной гиперплазией эпидермиса, гиперпаракератозом, очаговым агранулезом, формированием в эпидермисе микроабсцессов Мунро, расширением и извитостью капилляров в области сосочков дермы, наличием периваскулярных лимфогистиоцитарных инфильтратов в верхней части дермы [Самцов А.В., Теличко И.Н., Белоусова И.Э., Хайрутдинов В.Р. / Дерматовенерология // Учебник. Москва, 2016].

Недостатком данного метода является то, что гистологические изменения при псориазе в стационарный и регрессирующий периоды не всегда специфичны, следовательно, возрастает вероятность постановки ошибочного диагноза.

Известен другой способ диагностики псориаза, включающий микроскопическое исследование биологической ткани, для этого берут пробу сыворотки крови в объеме 20-25 мкл, наносят на поверхность предметного стекла в виде капли, высушивают в течении 18-24 ч при температуре 20-30С, и при выявлении на поверхности высушенной капли краевой - аморфной зоны, промежуточной - с единичными, рассеянными скобкообразными структурами и центральной - с округлыми структурами неправильной формы с пустотами и выемками, размещенными на фоне аморфной поверхности центральной зоны, диагностируют псориаз (Патент на изобретение №2476879, G01N 33/48, G01N 33/53, G01N 33/483, опубл. 27.02.2013).

Недостатком данного способа является его низкая специфичность и субъективность оценки полученного результата, что снижает достоверность диагностического теста.

Известен еще один способ дифференциальной диагностики клинической формы псориаза - псориатической эритродермии с применением иммуногистохимического исследования. Согласно изобретению при наличии выраженной экспрессии биомаркера IL-36γ в виде послойного позитивного окрашивания ядер и цитоплазматической мембраны клеток шиповатого и зернистого слоев эпидермиса диагностируют псориатическую эритродермию (Патент на изобретение №2466398, G01N 33/48, опубл. 10.11.2012).

Недостатком является то, что этот способ применяется только для диагностики эритродермий и не используется для дифференциальной диагностики бляшечного псориаза с другими хроническими заболеваниями кожи (бляшечная экзема, нейродермит, красный плоский лишай, грибовидный микоз).

В основу изобретения положена задача создания более достоверного и воспроизводимого способа дифференциальной диагностики бляшечного псориаза с другими хроническими заболеваниями кожи за счет установления значимого дифференциально-диагностического маркера, на основании детекции которого удастся произвести диагностику бляшечного псориаза. Целью работы стало изучение экспрессии интерлейкина-36γ в коже пациентов с бляшечным псориазом и пациентов с другими хроническими заболеваниями кожи на примере ограниченного нейродермита, бляшечной экземы, красного плоского лишая и грибовидного микоза.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе дифференциальной диагностики бляшечного псориаза с другими хроническими заболеваниями кожи, включающем проведение иммуногистохимического исследования биоптата пораженного участка кожи, с помощью светового микроскопа определяют экспрессию IL-36γ в эпидермисе; при определении экспрессии IL-36γ в виде специфического окрашивания ≥ 4 рядов клеток эпидермиса диагностируют бляшечный псориаз, при окрашивании от 2 до 3 рядов - диагноз сомнительный, а при окраске ≤ 1 ряда - диагноз псориаз исключают.

Технический результат заключается в повышении достоверности, эффективности, экономичности и воспроизводимости.

Проведение иммуногистохимического исследования с целью определения экспрессии цитокина IL-36γ в биоптатах кожи пациентов позволяет с высокой точностью диагностировать бляшечный псориаз, что важно при выборе терапии и определении прогноза заболевания.

Изобретение осуществляется следующим образом:

1. Предварительно подготавливают образцы кожи, которые вырезают так, чтобы в микроскопическом срезе сохранялись топографические соотношения, характерные для исследуемого материала.

2. Биоптат кожи помещают в емкость с фиксатором, объем фиксирующей жидкости превышал в 10-20 раз объем фиксируемого объекта. Если объект был разрезан на фрагменты толщиной более 5-6 мм, его оставляют в фиксаторе на 2-3 часа для уплотнения, после чего ткань рассекают на пластины толщиной 2-3 мм и помещают в свежий раствор фиксатора. Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20°С) составляет от 18 до 24 часов. В повседневной работе в качестве фиксирующей жидкости используют 10% раствор формалина или цинк-формалин, который обеспечивает сохранение антигенных детерминант для проведения иммуногистохимических исследований.

3. Обезвоживание и пропитывание парафином биоптатов кожи проводят вручную по восходящим спиртам (70%, 80%, 90% и 100%) в аппарате гистологической проводки тканей «Leica Peloris» («Leica Microsystems», Германия), заливают в парафин.

4. Срезы приготавливают толщиной 3-4 мкм. Используют микротом ротационный Accu-Cut®SRM™200.

5. После этого приступают к непрямому иммуногистохимическому исследованию. Для этого срезы наклеивали на стекла, обработанные полилизином, распарафинивают, блокируют эндогенную пероксидазу раствором перекиси водорода в метаноле и выполняют демаскировку антигенов путем нагревания в трис-ЭДТА или цитратном буфере в течение 30 мин при температуре 97°С на водяной бане. Для иммуногистохимической детекции, интерлейкина-36γ используют первичные мышиные моноклональные античеловеческие антитела (Таблица 1). Время инкубации с первичными антителами составляет 18-20 часов при t°=+40°С.

Для детекции клеток используют полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена применяют диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция). Инкубацию проводят с системой визуализации - 30 мин. при температуре +20°С для проявления результата реакции ДАБ наносится на срезы на 5 мин.

Выполняют подсчет количества рядов клеток эпидермиса окрашенных цветовой меткой при 200-кратном увеличении светового микроскопа в трех полях зрения (размерами 720×530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых участков. При выявлении 4-х и более окрашенных рядов клеток эпидермиса устанавливается диагноз бляшечный псориаз. При окрашивании от 2 до 3 рядов - диагноз сомнительный, а при окраске ≤ 1 ряда - псориаз исключается.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.

Пример 1.

Больной Иванов И.И., 20 лет, поступил в клинику для уточнения диагноза. Болен в течение 1 года, когда появились зудящие высыпания в поясничной области. На основании клинической картины врач проводит дифференциальную диагностику между ограниченным нейродермитом и бляшечным псориазом. Проведена биопсия пораженной кожи. Результаты гистологического исследования неспецифичны и не позволяют провести дифференциальную диагностику. Проведено иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии Il-36γ в пораженной коже.

Результаты: При ИГХ исследовании с использованием Anti-Il-36γ наблюдается выраженная экспрессия Il-36γ в зернистом и шиповатом слоях эпидермиса (>5 рядов клеток). На основании результатов ИГХ установлен диагноз: бляшечный псориаз. Назначена системная дезинтоксикационная, десенсибилизирующая терапия, наружная кератолитическая и противовоспалительная терапия (ТГКС), физиотерапия (УФО общее №10). После проведенного лечения на месте высыпаний сформировались гиперпигментные поствоспалительные пятна.

Пример 2.

Больная Петрова А.А., 45 лет, поступила в клинику для уточнения диагноза. Больна в течение 2-х месяцев, когда впервые стала отмечать появление отечных зудящих высыпаний на коже нижних конечностей. Лечилась самостоятельно топическими глюкокортикостероидными препаратами с нестойким эффектом. На основании клинической картины дерматолог проводит дифференциальную диагностику между бляшечной экземой и псориазом. Проведена биопсия пораженной кожи. Результаты гистологического исследования неспецифичны и не позволяют провести дифференциальную диагностику. Проведено иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии Il-36γ в пораженной коже.

Результаты: При ИГХ исследовании с использованием Anti-IL-36γ наблюдается экспрессия IL-36γ в зернистом слое эпидермиса (1 ряд клеток). На основании результатов ИГХ установлен диагноз: бляшечная экзема. Назначена системная десенсибилизирующая терапия, топические ГКС, антигистаминные средства, проведена санация очагов хронических инфекций. В ходе проведенного лечения клинические проявления полностью нивелировались.

Из анализа научно-технической и патентной литературы не обнаружено сведений о возможности проведения дифференциальной диагностики бляшечного псориаза и других хроническиих дерматозов на основании определения экспрессии интерлейкина-36γ в коже пациентов, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».