Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции с использованием каталазы

Изобретение относится к клиническим и лабораторным методам исследования и может быть использовано для количественного определения органических и неорганических гидропероксидов в модельных системах и биологических жидкостях.

Свободнорадикальные процессы играют важную роль в этиологии и патогенезе целого ряда заболеваний, таких как атеросклероз, сахарный диабет и др. Увеличение генерирования активных форм кислорода, включая супероксидный анион-радикал, может приводить к окислительным повреждениям липид-белковых надмолекулярных комплексов (биомембран и липопротеидов). Супероксидный анион-радикал способен дисмутировать с образованием пероксида водорода, причем в организме этот процесс катализирует фермент супероксиддисмутаза. В процессе окислительного стресса происходит одновременное накопление первичных продуктов свободнорадикального окисления - органических гидропероксидов (в частности, липогидропероксидов различного строения - ROOH) и неорганических гидропероксидов (пероксида водорода - Н₂О₂). Вследствие этого, существует необходимость в разработке способа для раздельного определения этих продуктов. Тем не менее, в настоящее время нет сведений о возможности одновременного определения органических и неорганических гидропероксидов в одних и тех же пробах. В работе Nourooz-Zadeh J. et al., Anal Biochem. 1994, 220: 403-409 была описана возможность раздельного определения ROOH и Н₂O₂ колориметрическим методом (с использованием реагента Fe-ксиленолоранж) после предварительного восстановления ROOH трифенилфосфином (ТФФ), который восстанавливал ROOH, но не Н₂O₂ (определение Н₂O₂ производили путем вычитания показаний пробы с ТФФ из показаний пробы без ТФФ).

Тем не менее, в проведенном исследовании способом индуцированной хемилюминесценции эти данные не нашли подтверждения, поскольку было установлено, что трифенилфосфин специфичным действием не обладает и не может быть использован в качестве реагента при раздельном определении органических и неорганических гидропероксидов.

Известные способы определения содержания органических гидропероксидов (ROOH, включая липопероксиды) были основаны либо на цветных реакциях, либо на определении поглощения конъюгированных диенов. Следует отметить, что колориметрические способы, в частности с использованием реагента Fe-ксиленолоранж (Nourooz-Zadeh J. et al., Anal Biochem. 1994, 220: 403-409), высокой чувствительностью не обладают и их использование для анализа биологического материала возможно только в случае концентрирования ROOH (например, путем препаративного выделения липопротеидов плазмы крови - Lankin V.Z. et al., Mol Cell Biochem. 2003, 249: 129-40). Очевидно, что подобные подходы непригодны для серийных клинических анализов.

Что касается спектрофотометрического определения уровня конъюгированных диенов, то обычно используемый способ по анализу спектра поглощения не может использоваться при анализе биологического материала, так как вследствие малого содержания ROOH пик их поглощения при 233 нм, как правило, не разрешен и для корректного определения необходим обсчет первых или вторых производных спектра, что позволяет делать далеко не каждый даже импортный спектрофотометр (Corongiu F.P. et. al., Methods Enzymol. 1994, 233: 303-10). Кроме того, при спектрофотометрическом определении в области поглощения 233 нм в природных системах определяются не только гидроперокси-производные липидов, но и продукты их восстановления - соответствующие окси-кислоты (при восстановлении гидропероксидов максимум поглощения практически не изменяется).

Известны также хемилюминесцентные способы определения органических гидропероксидов, обладающие большими преимуществами по сравнению с другими способами, ввиду весьма высокой чувствительности. Впервые использование хемилюминесцентного способа для определения органических гидропероксидов (ROOH) предложил Yamamoto Y. (Yamamoto Y. et al. Anal. Biochem. 1987, 160: 7-13). При этом гомолиз ROOH индуцировали микропероксидазой, а их разделение осуществляли при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Количественное определение ROOH осуществлялось при помощи хемилюминесцентного детектора после их разделения. Модификацию этого способа осуществили с применением люминола в качестве агента, увеличивающего квантовый выход хемилюминесценции (ХЛ). (Теселкин Ю.О. и Бабенкова И.В., Вестник РГМУ, 2011, 5: 54-58). А также с использованием в качестве усиливающего ХЛ агента изолюминола, что оказалось более целесообразным ввиду лучшей воспроизводимости результатов. (Проскурниной Е.В. и др. Журнал аналитической химии. - 2017, 72: 1-6).

Тем не менее, как следует из вышеизложенного, ни один из существующих способов, включая колориметрические,

спектрофотометрические и хемилюминесцентные, не позволяет проводить одновременно раздельное определение содержания органических и неорганических гидропероксидов в анализируемых пробах.

В связи с вышеизложенным, существует потребность в способе, позволяющем с высокой специфичностью проводить одновременное определение содержания органических и неорганических гидропероксидов в одной и той же пробе. Учитывая тот факт, что подобный способ может быть использован для проведения анализов в пробах биологического материала, одним из основных требований к способу определения является его высокая чувствительность.

Задачей изобретения является разработка простого и быстрого способа раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции, позволяющего применять его в качестве доступного лабораторного теста.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности и чувствительности способа.

Это достигается тем, что в заявляемом способе селективность определения ROOH и Н₂O₂ основана на предварительном высокоспецифичном ферментативном восстановлении Н₂O₂ с помощью каталазы, причем содержание ROOH рассчитывается путем вычитания светосуммы пробы после инкубации с каталазой из светосуммы под пиком общей хемилюминесцентной кривой.

Осуществление способа:

Хемилюминесцентный реагент (ХЛ-реагент), который используют в день приготовления и предварительно выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте до угасания собственной хемилюминесценции, содержит 200 нМ микропероксидазы-11 и 2 мкМ изолюминола в 20 мМ боратном буфере рН 10,0. Органический гидропероксид (ROOH - 13-гидропероксилинолеат) получают путем ферментативного окисления линолевой кислоты при катализе липоксигеназой-1 соевых бобов. Важно отметить, что липиды должны быть диспергированы без применения спиртовых растворов, поскольку в присутствии спиртов каталаза способна восстанавливать ROOM в ходе пероксидазной реакции. Далее, ROOH (13-гидропероксилинолеат) диспергируют в воде с помощью детергента дезоксихолата натрия (1/2; мкмоль/мкмоль).

Измерение ХЛ проводят на хемилюминометре Lum-100 (ДИсофт, Россия). Для проведения определения готовят две пробы.

Проба 1 (ROOH+H₂O₂): в хемилюминесцентную кювету помещают 25 мкл 1,2 мкМ дисперсии ROOH (13-гидропероксилинолеата) и 25 мкл 1,2 мкМ водного раствора H₂O₂.

Проба 2 (ROOH+H₂O₂ + каталаза) содержит те же ингредиенты, что и проба 1, но с добавлением 0,25 ед/мл каталазы и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Кювету с пробой 1 помещают в хемилюминометр и регистрируют собственную ХЛ образца в течение 60 сек, а затем впрыскивают через капиллярную трубку 950 мкл ХЛ-реагента и производят запись в течение 5 мин, после чего определяют площадь под ХЛ-кривой (светосумма ХЛ за 4 мин). По истечении времени инкубации проводят регистрацию ХЛ пробы 2. Количество органического гидропероксида определяют путем вычитания светосуммы ХЛ пробы 2 из светосуммы ХЛ пробы 1. Количественное определение 13-гидропероксилинолеата и H₂O₂ проводят с использованием соответствующих калибровочных графиков, построенных в координатах: по абсциссе - концентрация гидропероксидов в нМ; по ординате - светосумма ХЛ.

Пример 1 раздельного определения ROOH и H₂O₂ в смеси этих компонентов.

Раздельное хемилюминесцентное определение концентрации органического (13-гидропероксилинолеата) и неорганического (Н₂О₂) гидропероксидов в их смеси (1/1 в нмолях) предлагаемым способом показаны в таблице 1. Полученные ХЛ-кривые представлены на Фиг. 1, где ХЛ-кривые: 1 - смесь 13-гидропероксилинолеата и пероксида водорода (1/1), 2 - то же+каталаза (0,25 ед/мл), 3 - 13-гидропероксилинолеат (30 нМ), 4 - пероксид водорода (30 нМ). Результаты приведены в условных единицах ХЛ (светосумма за 4 мин в имп.х 10).

Экспериментально определенное содержание ROOH (13-гидропероксилинолеата) в пробе смеси эквимолярных количеств органического и неорганического (Н₂O₂) гидропероксидов после утилизации Н₂O₂ каталазой представляют данные пробы 2, причем расхождение с определенным тем же способом содержанием чистого ROOH - 13-гидропероксиксилинолеата (994±123) составляет 9,5%. Содержание Н₂O₂ в смеси эквимолярных количеств ROOH и Н₂O₂ определяется путем вычитания данных пробы 2 (после утилизации пероксида водорода каталазой) из данных пробы 1 (смесь 13-гидропероксилинолеата и Н₂O₂), причем расхождение с определенным тем же способом содержанием чистого Н₂O₂ (807±57) составляет 10%.

Следовательно, содержание органических гидропероксидов -ROOH (в данном примере - 13-гидроперокси линолеат) и неорганических гидропероксидов (Н₂O₂) по предлагаемому способу осуществляется по формулам:

1) [ROOH]=[ROOH+Н₂O₂+каталаза] или [ROOH]=показателю пробы 2;

2) [Н₂O₂]=[ROOH+Н₂O₂] - [ROOH] или

[Н₂O₂]=показатель пробы 1 минус показатель пробы 2, где [ROOH] и [Н₂O₂] - концентрации органического и неорганического гидропероксидов соответственно.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с достаточно высокой точностью и чувствительностью (определяются наномолярные количества веществ, что почти на 3 порядка превышает чувствительность спектрофотометрических методов) с абсолютной специфичностью (исходя из абсолютной специфичности каталазной реакции) производить раздельное определение органических гидропероксидов и пероксида водорода в средах, содержащих смесь этих компонентов.