Способ профилактики нарушений функций почек карбамилированным дарбэпоэтином в эксперименте

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и урологии.

Острое почечное повреждение остается серьезной проблемой здравоохранения, особенно у госпитализированных и критических пациентов, и является основным фактором риска развития хронического заболевания почек [Belayev L.Y., Palevsky P.M. The link between acute kidney injury and chronic kidney disease. // Curr Opin Nephrol Hypertens – 2014. – 23. – 149-154; Coca S.G., Singanamala S., Parikh C.R. Chronic kidney disease after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. // Kidney Int – 2012. – 81. – 442-448]. Несмотря на поддерживающий уход с использованием заместительной почечной терапии, острая почечная недостаточность по-прежнему связана с увеличением краткосрочной и долгосрочной смертности не только из-за почечной недостаточности, но и из-за сопутствующей дисфункции других органов и систем [Kao C.C., Yang W.S., Fang J.T., et al. Remote organ failure in acute kidney injury. // Journal of the Formosan Medical Association. – 2018]. Ведущей причиной острого почечного повреждения является недостаточная перфузия тканей почек, усугубляющаяся дальнейшей реперфузией [Martin, J.L., Gruszczyk, A.V., Beach, T.E. et al. Mitochondrial mechanisms and therapeutics in ischaemia reperfusion injury // Pediatr Nephrol – 2018. https://doi.org/10.1007/s00467-018-3984-5].

Известен способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Sharples E.J., Patel N., Brown P., et al.: Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol 15: 2115–2124, 2004), включающий моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки крысам-самцам линии Wistar на 45 минут. Для профилактики ишемически-реперфузионной травмы использовали однократное внутривенное введение эритропоэтина в дозе 300 МЕ/кг за 30 или 5 минут до ишемического стимула. Способ обеспечивает уменьшение клубочковых и канальцевых повреждений (по биохимическим и гистологическим критериям), предотвращало активацию каспаз-3, -8 и -9 in vivo и снижение апоптотической гибели клеток.

Основным недостатком способа является то, что оценка ренопротективных свойств производится через 6 часов реперфузии, когда выраженность патологических изменений минимальна, что не может свидетельствовать об эффективной профилактике данного рода повреждений. С другой стороны, биохимические критерии повреждения включают оценку концентрации креатинина и расчет скорости клубочковой фильтрации, отражаяя лишь степень выраженности повреждений клубочкового аппарата и не учитывают колебания уровня мочевины, которая раньше, чем креатинин реагирует на повреждение ткани почек.

Другой способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Okada T, Sawada T, Kubota K. Asialoerythropoietin has strong renoprotective effects against ischemia-reperfusion injury in a murine model. // Transplantation. 2007 Aug 27;84(4):504-10.) включает моделирование патологии путем удаления левой почки и наложения атравматичного зажима на правую почечную ножку лабораторных мышей-самок на 60 минут. Для профилактики ишемически-реперфузионной травмы использовали однократное подкожное введение асиалированного эритропоэтина в дозе 500 МЕ/кг за 30 минут до ишемического стимула. Способ обеспечивает снижение концентрации креатинина и мочевины через 24 часа, уменьшение количества клеток в стадии апоптоза и улучшает выживаемость животных на 7 сутки эксперимента.

Основным недостатком способа является то, что используемая модель позволяет оценить изменения лишь при наличии одной почки, тогда как в условиях клинической практики ишемически-реперфузионные повреждения чаще встречаются у лиц с двумя почками, кроме того, отсутствует мониторинг критериев острого почечного повреждения в динамике в периоды максимальной выраженности патологических изменений, что не может свидетельствовать об эффективной профилактике данного рода повреждений. С другой стороны, использование в качестве лабораторных животных самок, не позволяет исключить усиление протективных свойств эстрогенов.

Наиболее близким к заявленному является способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Lempiäinen J, Finckenberg P, Levijoki J, Mervaala E. AMPK activator AICAR ameliorates ischaemia reperfusion injury in the rat kidney. British Journal of Pharmacology. 2012;166(6):1905-1915. doi:10.1111/j.1476-5381.2012.01895.x.), включающий воспроизведение модели патологии путем наложения на почечные ножки атравматичных зажимов на 40 минут с последующей реперфузией и введение лабораторному животному 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида в дозе 500 мг/кг однократно, причем, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида вводят внутривенно за 30 минут до моделирования ишемии и выраженность нефропротективных свойств производят однократно через 24 часа реперфузии без расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия.

Основным недостатком способа является то, что профилактика нарушений функций почек оценивается только с помощью измерения сывороточных концентраций креатинина и мочевины без расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия, а также отсутствия данных о динамике на третьи сутки эксперимента, когда патологические изменения достигают своего максимума, что не позволяет полностью говорить об эффективной профилактике нарушений функций почек в эксперименте.

С другой стороны, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозид в клинических исследованиях III фазы не подвердил свою эффективность при ишемических и реперфузионных повреждениях сердца, имеющих сходный патогенез с изучаемой моделью [Pokrywka A, Cholbinski P, Kaliszewski P, Kowalczyk K, Konczak D, Zembron-Lacny A. Metabolic modulators of the exercise response: Doping control analysis of an agonist of the peroxisome proliferator-activated receptor δ (GW16) and 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR). J Physiol Pharmacol. 2014;65(4):469–76.]. Кроме того, в качестве средства для наркоза использовался изофлуран, который по данным литературы обладает нефропротективной активностью, что могло исказить полученные результаты исследования [Carraretto, A.R. et al. Does propofol and isoflurane protect the kidney against ischemia/reperfusion injury during transient hyperglycemia?. Acta Cir. Bras. [online]. 2013, vol.28, n.3 pp.161-166.].

Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа профилактики нарушений функций почек с использованием карбамилированного дарбэпоэтина.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ профилактики нарушений функций почек с использованием карбамилированного дарбэпоэтина, включающий профилактику лекарственным средством путем однократного введения его раствора белым лабораторным животным с последующим моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки на 40 минут с последующей реперфузией кровотока в почках, причем в качестве лабораторных животных используют белых крыс линии Wistar, в качестве лекарственного средства используют карбамилированный дарбэпоэтин, вводимый в дозе 50 мкг/кг подкожно в область холки за 24 часа до моделирования ишемии, а оценку выраженности изменения функциональных показателей производят через 24 и 72 часа реперфузии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ профилактики нарушений функций почек с использованием карбамилированного дарбэпоэтина в эксперименте, подтверждаемого результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия.

Карбамилированные формы более активного, чем эритропоэтин, дарбэпоэтина обладают улучшенным фармакокинетическим профилем и характеризуются отсутствием эритропоэтических свойств (Cassis P., Azzollini N., Solini S., et al. Both darbepoetin alfa and carbamylated erythropoietin prevent kidney graft dysfunction due to ischemia/reperfusion in rats. // Transplantation. – 2011. – 92(3). – P. 271-9. doi: 10.1097/TP.0b013e3182241106; Search of new pharmaceuticals on the basis of darbepoetin in the treatment of ischemic stroke (review of literature) / K.M. Reznikov, N.S. Gorbunova, P.D. Kolesnichenko, A.V. Tverskoy, D.A. Kostina, D.A. Bashkatova, V.A. Nikitina // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №1 – P. 125-136. doi: 10.18413/2500-235X-2017-3-1-125-136.).

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение карбамилированного дарбэпоэтина в дозе 50 мкг/кг однократно за 24 часа до индукции ишемии приводит к выраженной профилактике нарушений функций почек в эксперименте, что подтверждается результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Эксперименты проведены на 80 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим.

Выбор крыс-самцов в эксперименте связан с наличием циклических гормональных изменений у самок и ренопротективных эффектов у эстрогенов, что может повлиять на чистоту эксперимента.

Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа – группа ложнооперированных животных (24 часа), вторая группа – группа ложнооперированных животных (72 часа), третья группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 24 часа), четвертая группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 72 часа), пятая группа – с коррекцией патологии карбамилированным дарбэпоэтином (24 часа реперфузии), шестая группа – с коррекцией патологии карбамилированным дарбэпоэтином (72 часа реперфузии), седьмая группа – с коррекцией патологии дарбэпоэтином (препарат сравнения, 24 часа реперфузии), восьмая группа – с коррекцией патологии дарбэпоэтином (препарат сравнения, 72 часа реперфузии).

Моделирование ишемически-реперфузионного повреждения почек производили следующим образом: под общей анестезией (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) производили срединную лапаротомию, выделяли почечные ножки и последовательно накладывали атравматичные сосудистые зажимы на обе ножки с ишемическим периодом 40 минут под контролем микроциркуляции. Далее производили снятие зажимов, промывали брюшную полость 0,9% раствором натрия хлорида и послойно ушивали рану. Для получения образцов мочи, животных помещали в метаболические клетки со свободным доступом к воде на 12 или 24 часа. Далее измерялся диурез и отбирались образцы для дальнейшего исследования. Через 24 или 72 часа реперфузии лабораторное животное наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела животного, производили релапаротомию и отбирали кровь из правого желудочка для биохимических исследований.

В пятой и шестой экспериментальных группах животным за 24 часа до наложения сосудистых зажимов вводили карбамилированный дарбэпоэтин (ООО «Фармапарк») в дозе 50 мкг/кг однократно подкожно в область холки. В седьмой и восьмой экспериментальных группах животным за 24 часа до наложения сосудистых зажимов вводили дарбэпоэтин в дозе 0,45 мкг/кг однократно подкожно в область холки.

О выраженности ренопротективных свойств судили по результатам биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа реперфузионного периода.

Уровень сывороточного креатинина и мочевины определяли фотоколориметрическим методом с помощью стандартных наборов реактивов. Концентрация ионов калия и натрия в сыворотке крови определялась по стандартной методике, прилагаемой к наборам на автоматическом анализаторе.

Клиренс эндогенного креатинина (скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитывался следующим образом:

Фракционная экскреция натрия (FEna) рассчитывалась по следующей формуле:

Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Для расчётов использовали программу статистического анализа Microsoft Excel.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Через 24 часа реперфузии в группе с моделированием патологии уровень креатинина сыворотки крови не отличался достоверно от группы ложнооперированных животных и составлял 60±2,39 мкмоль/л и 56,3±1,37 мкмоль/л соответственно. Однако за счет снижения диуреза отмечалось падение скорости клубочковой фильтрации с 0,47±0,05 мл/мин в группе ложнооперированных животных до 0,16±0,01 мл/мин в группе ишемии-реперфузии. Через 72 часа отмечалось прогрессирующее снижение фильтрационной способности почек, выражающееся в нарастании уровня сывороточного креатинина с 59,5±3,28 мкмоль/л до 136,8±7,02 мкмоль/л и снижении скорости клубочковой фильтрации с 0,49±0,03 мл/мин в группе ложнооперированных животных до 0,05 мл/мин в группе с моделированием патологии.

Исследование сывороточной концентрации мочевины продемонстрировало, что моделирование 40-минутной билатеральной модели ишемии-реперфузии почек приводило к росту данного показателя через 24 часа реперфузии с 5,82±0,25 ммоль/л до 10,96±0,33 ммоль/л, которое несколько нивелировалось через 72 часа, достигая уровня 8,85±0,44 ммоль/л.

В группе ложнооперированных животных уровень фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа составлял 0,46±0,02% и 0,48±0,03%. Моделирование острого почечного повреждения ишемически-реперфузионного генеза приводило к росту FeNa до 2,12±0,25% до 9,42±0,7% через 24 и 72 часа реперфузии соответственно.

Профилактика нарушений функций почек карбамилированным дарбэпоэтином приводила к снижению сывороточной концентрации креатинина через 72 часа реперфузии до 70,8±3,1 мкмоль/л и росту скорости клубочковой фильтрации до 0,29±0,02 мл/мин и 0,33±0,04 мл/мин на первые и третьи сутки эксперимента соответственно, отличаясь достоверно от показателей группы контроля и группы препарата сравнения (p<0,05) Уровень сывороточной концентрации мочевины также снижался до 6,14±0,31 ммоль/л и 6,52±0,28 ммоль/л через 24 и 72 часа реперфузии соответственно. Фракционная экскреции натрия на фоне профилактического применения карбамилированного дарбэпоэтина, отражающая канальцевую дисфункцию также снижалась, составляя 1,05±0,05% и 1,31±0,11% в различные временные точки эксперимента, превосходя по эффективности препарат сравнения.

Профилактика нарушений функций почек дарбэпоэтином приводила к снижению сывороточной концентрации креатинина через 72 часа реперфузии до 85,1±1,68 мкмоль/л и росту скорости клубочковой фильтрации до 0,21±0,02 мл/мин и 0,22±0,01 мл/мин на первые и третьи сутки эксперимента соответственно, отличаясь достоверно от показателей группы контроля лишь на третьи сутки эксперимента (p<0,05) Уровень сывороточной концентрации мочевины снижался до 7,13±0,27 ммоль/л и 7,15±0,37 ммоль/л через 24 и 72 часа реперфузии соответственно. Фракционная экскреции натрия на фоне профилактического применения дарбэпоэтина составила 1,37±0,08% и 2,36±0,07% в различные временные точки эксперимента. Динамика биохимических маркеров острого почечного повреждения, скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Динамика биохимических маркеров острого почечного повреждения в экспериментальных группах (М±m; n=10)

Примечание: ^x – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; ^y – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.

Таблица 2

Динамика скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия в экспериментальных группах (М±m; n=10)

Примечание: ^x – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; ^y – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.

Таким образом, в предлагаемом способе подкожное введение карбамилированного дарбэпоэтина в дозе 50 мкг/кг однократно за 24 часа до индукции ишемии приводит к более выраженной профилактике нарушений функций почек, чем введение дарбэпоэтина в дозе 0,45 мкг/кг, что подтверждается результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа реперфузионного периода.