Способ профилактики ишемически-реперфузионных повреждений почек ингибитором аргиназы II в эксперименте

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и урологии.

В течение последних 25 лет частота возникновения острого почечного повреждения возросла в 20 раз и составляет в среднем 13-20% всех госпитализаций [Заморский И.И. Щудрова Т.С. Линькова Н.С. и др. Нефропротективное действие пептида EDL при остром повреждении почек различного генеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2017. – №3. – С. 376-381]. Параллельно росту заболеваемостью острым почечным повреждением увеличиваются инвалидизация и смертность от данного состояния. Ишемическое повреждение почки, усугубляющееся впоследствии реперфузией органа, является ведущей патогенетической причиной в этиологии острого почечного повреждения [Янкаускас С.С., Мациевский Д.Д., Плотников Е.Ю. и др. Использование высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники для исследования почечного кровотока при ишемии/реперфузии почки. // Нефрология и диализ. – 2014. – №1. – С. 169-173].

В патогенезе ишемически-реперфузионных повреждений почек важную роль играет фермент, регулирующий обмен L-аргинина и оксида азота – аргиназа, существующая в двух изоформах: аргиназа I и аргиназа II [Arginase-2 mediates renal ischemia-reperfusion injury / Raup-Konsavage W.M., Gao T., Cooper T.K., et al. // American Journal of Physiology-Renal Physiology. – 2017. – 313:2. – F522-F534].

Известен способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Arginase-2 mediates renal ischemia-reperfusion injury / Raup-Konsavage W.M., Gao T., Cooper T.K., et al. // American Journal of Physiology-Renal Physiology. – 2017. – 313:2. – F522-F534), включающий моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки лабораторных мышей на 28 минут. Для профилактики ишемически-реперфузионной травмы использовали однократное внутрибрюшинное введение неселективного ингибитора аргиназ S-(2-бороноэтил)-L-цистеина за 18 часов до ишемического стимула. Способ обеспечивает уменьшение выраженности гистопатологических изменений, процессов оксидативного стресса и апоптоза, синтез провоспалительных цитокинов; увеличивало образование оксида азота и фосфорилирование eNOS, экспрессию коактиватора 1 альфа γ-рецептора-активатора пролиферации пероксисом и способствовало сохранению митохондриальной ультраструктуры.

Основным недостатком способа является то, что для профилактики в качестве фармакологического агнета используется неселективный ингибитор фермента аргиназы, который снижает активность как аргиназы II, так и аргиназы I. Вследствие подавления активности аргиназы I у животных могут наблюдаться такие побочные эффекты, как гипераммониемия, проявляющаяся в недостаточности цикла ферментов мочевины и приводящая к отравлению организма аммиаком, что может усугублять симптомы накопления других продуктов азотистого обмена при остром почечном повреждении – креатинина и мочевины.

Наиболее близким к заявленному является способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Lempiäinen J, Finckenberg P, Levijoki J, Mervaala E. AMPK activator AICAR ameliorates ischaemia reperfusion injury in the rat kidney. // British Journal of Pharmacology. – 2012. – 166(6). – 1905-1915. doi:10.1111/j.1476-5381.2012.01895.x.), включающий воспроизведение модели патологии путем наложения на почечные ножки атравматичных зажимов на 40 минут с последующей реперфузией и введение лабораторному животному 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида в дозе 500 мг/кг однократно, причем, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида вводят внутривенно за 30 минут до моделирования ишемии и выраженность нефропротективных свойств производят однократно через 24 часа реперфузии без оценки выраженности изменений в клубочках и морфометрии.

Основным недостатком способа является то, что профилактика ишемии при гистологическом исследовании подтверждается только полуколичественной оценкой острого канальцевого некроза без учета выраженности изменений в корковом веществе почек, отвечающим за клубочковую фильтрацию и отсутствием оценки процесса на третьи сутки эксперимента, когда патологические изменения достигают своего максимума, что не позволяет полностью говорить об эффективной профилактике ишемически-реперфузионных повреждений почек в эксперименте.

С другой стороны, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозид в клинических исследованиях III фазы не подвердил свою эффективность при ишемических и реперфузионных повреждениях сердца, имеющих сходный патогенез с изучаемой моделью [Pokrywka A, Cholbinski P, Kaliszewski P, et al. Metabolic modulators of the exercise response: Doping control analysis of an agonist of the peroxisome proliferator-activated receptor δ (GW16) and 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR). – J Physiol Pharmacol. – 2014. – 65(4). – 469-76.]. Кроме того, в качестве средства для наркоза использовался изофлуран, который по данным литературы обладает нефропротективной активностью, что могло исказить полученные результаты исследования [Carraretto, A.R. et al. Does propofol and isoflurane protect the kidney against ischemia/reperfusion injury during transient hyperglycemia?. Acta Cir. Bras. [online]. 2013, vol.28, n.3, pp.161-166.].

Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа профилактики ишемически-реперфузионного повреждения почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975 в эксперименте.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ профилактики ишемически-реперфузионного повреждения почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975, включающий профилактику лекарственным средством путем однократного введения его раствора белым лабораторным животным с последующим моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки на 40 минут с последующей реперфузией кровотока в почках, причем в качестве лабораторных животных используют белых крыс линии Wistar, в качестве лекарственного средства используют ингибитор аргиназы II KUD975, вводимый в дозе 3 мг/кг внутрижелудочно через зонд за 120 минут до моделирования ишемии, а оценку нефропротективных свойств проводят через 24 и 72 часа реперфузии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ профилактики ишемически-реперфузионного повреждения почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975 в эксперименте, подтверждаемого результатами гистологического исследования с морфометрией высоты эпителия в проксимальном и дистальном отделах нефрона, площади поперечного сечения почечного тельца и сосудистого клубочка.

Исследуемое нами вещество KUD975 представляет собой синтезированное соединение фенольной природы - метиловый эфир (2-((1-гидроксинафталин-2-ил)тио)ацетил)-D-пролина.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение ингибитора аргиназы II KUD975 в дозе 3 мг/кг однократно за 120 минут до индукции ишемии приводит к выраженной профилактике ишемически-реперфузионных повреждений почек в эксперименте, что подтверждается результатами гистологического исследования с морфометрией.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Эксперименты проведены на 70 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим.

Выбор крыс-самцов в эксперименте связан с наличием циклических гормональных изменений у самок и ренопротективных эффектов у эстрогенов, что может повлиять на чистоту эксперимента.

Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа – группа ложнооперированных животных, вторая группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 24 часа), третья группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 72 часа), четвертая группа – с коррекцией патологии ингибитором аргиназы II KUD975 (24 часа реперфузии), пятая группа – с коррекцией патологии ингибитором аргиназы II KUD975 (72 часа реперфузии), шестая группа – с коррекцией патологии L-норвалином (препарат сравнения, 24 часа реперфузии), седьмая группа – с коррекцией патологии L-норвалином (препарат сравнения, 72 часа реперфузии).

Моделирование ишемически-реперфузионного повреждения почек производили следующим образом: под общей анестезией (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) производили срединную лапаротомию, выделяли почечные ножки и последовательно накладывали атравматичные сосудистые зажимы на обе ножки с ишемическим периодом 40 минут под контролем микроциркуляции. Далее производили снятие зажимов, промывали брюшную полость 0,9% раствором натрия хлорида и послойно ушивали рану. Через 24 или 72 часа после эксперимента животных подвергали эвтаназии с последующим забором почек для морфологического исследования.

В четвертой и пятой экспериментальных группах животным за 120 мин до наложения сосудистых зажимов вводили ингибитор аргиназы II KUD975в дозе 3 мг/кг однократно внутрижелудочно через зонд. В шестой и седьмой экспериментальных группах животным за 30 мин до наложения сосудистых зажимов вводили L-норвалин в дозе 100 мг/кг однократно внутрибрюшинно.

О выраженности протективного эффекта судили по результатам гистологического исследования с морфометрией высоты эпителия в проксимальном и дистальном отделах нефрона, площади поперечного сечения почечного тельца и сосудистого клубочка через 24 или 72 часа реперфузионного периода.

Для проведения гистологического исследования полученный кадаверный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина. По завершении фиксации из биоматериала иссекали участок тканей размерами 1х1 см, заливали в парафин по стандартной методике и изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм.

Полученные гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизонн, по Маллори.

Микроскопирование и фотографирование осуществляли с помощью оптической системы, состоящей из микроскопа Leica CME и окуляр-камеры DCM – 510. Морфометрическое исследование включало в себя определение следующих показателей: на микрофотографиях с использованием программы Imago J проводили измерение высоты эпителиоцитов в проксимальном и дистальном отделах нефрона, измерение площади поперечного сечения почечного тельца и сосудистого клубочка.

Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Для расчётов использовали программу статистического анализа Microsoft Excel.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

При микроскопическом изучении гистологических срезов почки у ложнооперированных животных регистрировались нормальные морфометрические показатели: высота эпителия в проксимальных канальцах составила 11,28±1,56 мкм, в дистальных канальцах – 7,08±1,43 мкм. Площадь поперечного сечения почечного тельца и сосудистого клубочка составляли 10318,97±83,74 мкм² и 6449,95±40,42 мкм² соответственно. Данные показатели свидетельствуют о нормальной микроскопической картине в корковом и мозговом веществе почек.

Через сутки после оперативного вмешательства высота проксимальных эпителиоцитов снизилась в 1,4 раза в сравнении с ложнооперированными животными. К 3-им суткам было выявлено достоверное (р≤0,05) уменьшение высоты уже в 1,7 раза (6,56±0,74 мкм). В дистальных отделах нефрона изменение высоты эпителия имело туже тенденцию. При этом, максимальное снижение высоты эпителиоцитов в 1,7 раза (р≤0,05) происходило через 3-е суток после оперативного вмешательства и составило - 4,24±0,73 мкм.

Относительно изменений площади поперечного сечения почечного тельца и сосудистого клубочка, было выявлено, что на фоне незначительного уменьшения размеров почечного тельца, снижение показателей площади сосудистого клубочка было достоверно (р≤0,05) меньше в 1,7 раза, что вполне объяснимо увеличением количества в поле зрения почечных телец со сморщенными сосудистыми клубочками.

На фоне коррекции ингибитором аргиназы II KUD975 через 24 часа реперфузии высота эпителия проксимальных и дистальных канальцев увеличивалась до 9,4±0,09 мкм и 6,61±0,09 мкм соответственно. Площадь сосудистого клубочка увеличивалась до 5848,69±80,87 мкм² при параллельном увеличении площади почечного тельца до 9929,89±113 мкм².

На фоне коррекции L-норвалином через 24 часа реперфузии высота эпителия проксимальных и дистальных канальцев увеличивалась до 8,38±0,1 мкм и 6,5±0,08 мкм соответственно. Площадь сосудистого клубочка увеличивалась до 5690,58±88,22 мкм² при параллельном увеличении площади почечного тельца до 9882,41±104,55 мкм².

Схожая динамика отмечалась и через 72 часа реперфузии: высота эпителия проксимальных и дистальных канальцев увеличивалась до 8,57±0,1 мкм и 6,19±0,1 мкм соответственно, достоверно отличаясь от группы контроля и L-норвалина (р≤0,05). Площадь сосудистого клубочка также возрастала до 4867,97±62,17 мкм² при параллельном увеличении площади почечного тельца до 9952,29±128,88 мкм².

На фоне коррекции L-норвалином через 72 часа реперфузии высота эпителия проксимальных и дистальных канальцев увеличивалась до 7,98±0,1 мкм и 5,55±0,1 мкм соответственно, достоверно отличаясь от группы контроля (р≤0,05). Площадь сосудистого клубочка увеличивалась до 4240,73±54,92 мкм² при параллельном увеличении площади почечного тельца до 9587,35±134,13 мкм². Динамика результатов морфометрии структур почек представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Динамика результатов морфометрии высоты эпителия канальцев в экспериментальных группах (мкм, M±m, n=10)

Примечание: ^a – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; ^b – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.

Таблица 2

Динамика результатов морфометрии клубочковых структур в экспериментальных группах (мкм², M±m, n=10)

Примечание: ^a – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; ^b – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.

Таким образом, в предлагаемом способе внутрижелудочное введение ингибитора аргиназы II KUD975 в дозе 3 мг/кг однократно за 120 минут до индукции ишемии приводит к более выраженной профилактике ишемически-реперфузионных повреждений почек, чем введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг, что подтверждается результатами гистологического исследования с морфометрией через 24 и 72 часа реперфузионного периода.