Способ определения бактериального эндотоксина в биологических жидкостях

Область техники

Изобретение относится к области медицины и клинической лабораторной диагностики. Более подробно изобретение относится к способу (методу) определения уровня эндотоксина, основанному на реакции in vitro между бактериальным эндотоксином (БЭ) и ЛАЛ-реактивом в биологических жидкостях (плазме крови и моче и т.п.).

Уровень техники

Известен ряд способов (методов) определения бактериальных эндотоксинов (БЭ) в биологических жидкостях, например, по следующим патентным документам: патенту РФ RU 2325645 (МПК G01N 33/48, G01N 33/579, опубл. 27.05.2008 Бюл. №15), японскому патенту JP 4761448 (МПК G01N 33/48; G01N 33/579, опубл. 2011-08-31), японской патентной заявке JP 2003232794 (МПК G01N 33/579, опубл. 2003-08-22), китайскому патенту CN 1696636 (МПК G01N 1/28, опубл. 2005-11-16), международной РСТ-заявке WO 2009005231 (МПК G01N 33/49, G01N 33/579, опубл. 2009-01-08).

По патенту RU 2325645 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТАЛ-ТЕСТА, В КОТОРОМ РЕГИСТРАЦИЮ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛИМЕРА КОАГУЛОГЕНА ПРОИЗВОДЯТ ПО СТРУКТУРЕ ОБРАЗУЮЩИХСЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКТАЛОВ, проводят в биологических средах и лекарственных средствах. Сущность способа: смешивают тахплеус лизат (ТАЛ) и разведения исследуемого образца нанесением на апирогенную поверхность, инкубируют с закрытой крышкой в течение 30…60 мин при 37°С, выдерживают апирогенную поверхность в термостате при открытой крышке до высыхания капель смеси реагентов, регистрируют образование полимера коагулогена под увеличением по образующимся белковым фракталам и при их наличии определяют активность эндотоксина в последнем разведении.

Недостатком способа является его невысокая точность из-за субъективного визуального контроля результатов теста, в отличие от измерения оптической плотности в результате хромогенного анализа, использующегося в предлагаемом способе. Кроме того, использование ТАЛ-реагента (лизат мечехвостов вида Tachypleus tridentatus) также накладывает определенные ограничения на его применение, в связи со сложностью его приобретения на территории РФ (необходимо ждать поставок из Китая), в отличие от ЛАЛ-реактива, который широко и активно применяется повсеместно.

Способ по патенту JP 4761448 BLOOD ENDOTOXIN MEASURING METHOD направлен на количественное измерение эндотоксина в крови, которое не может быть получено обычными методами, и уточняет связь между количеством эндотоксина в крови и клиническим состоянием. В способе отделяются только эритроциты и удаляются из цельной крови, а количество эндотоксина, содержащегося в оставшейся частице крови, измеряется, тем самым корректируя эндотоксин, содержащийся в лейкоцитах и эндотоксине, содержащемся в плазме.

Недостатком способа является возможность его применения исключительно для анализа крови, в отличие от предлагаемого способа, позволяющего оценивать содержание БЭ в разных биологических жидкостях.

Способ по патентной заявке JP 2003232794 METHOD FOR MEASURING ENDOTOXIN ACTIVITY предназначен для точного и быстрого измерения активности эндотоксина методом ЛАЛ-теста (реагент Limulus Amebocyte Lysate (лимулус лизат, сокращенно ЛАЛ) с применением предварительной обработки образца, которая включает в себя стадии добавления поверхностно-активного вещества в образец с последующей ультразвуковой обработкой. Поверхностно-активное вещество представляет собой анионное вещество, его концентрация в образце составляет менее 0,01%. Измерение содержания бактериального эндотоксина проводят методом турбидиметрического ЛАЛ-теста.

Особенностью этого способа является специфичная предварительная обработка, существенно отличающаяся от обработки, используемой в предлагаемом способе.

Аналог по подготовке образцов крови для тестирования БЭ - способ по патенту CN 1696636 METHOD FOR PREPARING BLOOD FOR TESTING ENDOTOXIN OF BACTERIA включает приготовление сыворотки крови, добавление нескольких раз 0,1…0,3% qulatong (Х-100) в небольшое количество сыворотки крови, нагревание в водяной бане, обработку в ледяной бане, разбавление апирогенной водой и смешивание небольшого количества разбавленной жидкости с таким же количеством реагента лизата Tachypleus tridentatus для получения кровяного продукта, который используется для обнаружения бактериальных эндотоксинов.

Недостатком способа является сложность предварительной обработки образцов для исследования, а также узость его применения только в крови, а не в разных биологических жидкостях, как в предлагаемом способе. Кроме того, также, как и в патенте RU 2325645 в качестве реагента для определения используется лизат, выделенный из мечехвостов вида Tachypleus tridentatus, в отличие от применяемого в нашем изобретении лизата амебоцитов Limulus Polyphemus, являющегося более распространенным и легкодоступным реагентом.

Способ по РСТ-заявке WO 2009005231 METHODS FOR QUANTITATIVELY DETERMINING ENDOTOXIN (количественного определения эндотоксина в биологическом образце) включает в себя этапы: (а) получение биологического образца; (б) термическая обработка биологического образца; (в) получение реакционного раствора путем добавления ЛАЛ-реагента (реагента Limulus Amebocyte Lysate (сокращенно ЛАЛ) в инактивированный биологический образец; и (г) измерение значения оптической плотности реакционного раствора после определенного времени реакции или измерения времени, когда раствор достигает заданного значения оптической плотности. С помощью изобретения можно определять количество эндотоксина в биологическом образце более точным и удобным образом.

Основным недостатком этого способа является использование турбидиметрического ЛАЛ-теста (кинетического и по конечной точке). Такая модификация ЛАЛ-теста требует дорогостоящего и узкоспецифичного оборудования - микропланшетного ридера для регистрации изменения оптической плотности, вызванной помутнением исследуемых образцов. В отличие от этого в предлагаемом способе определение содержания БЭ происходит при помощи хромогенного ЛАЛ-теста, что позволяет использовать любой лабораторный спектрофотометр.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка более универсального способа, пригодного для количественного определения БЭ в разных видах биологических жидкостей, в т.ч. в плазме крови и в моче, используя метод хромогенного ЛАЛ-теста для определения БЭ со специфичной предварительной обработкой образцов из разных видов биологических жидкостей. Преимуществом хромогенного метода анализа является отсутствие необходимости использовать дорогостоящее оборудование, а также высокая чувствительность и специфичность метода.

Задача решается способом определения бактериального эндотоксина в биологических жидкостях, характеризующимся зависящей от вида биологической жидкости предварительной подготовкой образцов для последующего хромогенного ЛАЛ-теста, проведение реакции подготовленных образцов с ЛАЛ-реактивом и спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах после реакции с ЛАЛ-реактивом, при этом реакция образцов с ЛАЛ-реактивом включает: внесение в стерильные пробирки 100 мкл обработанных образцов биологических жидкостей, загрязненных эндотоксином, и добавление 100 мкл ЛАЛ-реактива (прим.: в реальных анализах заранее наведенные растворы с известными концентрациями БЭ используют в качестве калибровочной кривой. При анализе биологической жидкости больного, в которой необходимо определить содержание БЭ, она обрабатывается по методике, описанной в примерах осуществления способа. В результате определяется значение оптической плотности при длине волны 388 нм (этой длине волны соответствует максимум поглощения комплекса хромогенного ЛАЛ субстрата с БЭ), далее это значение сравнивается со значениями, полученными для конкретных концентраций эндотоксина, и делается вывод, сколько БЭ было в биологической жидкости больного). Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты; спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах включает измерение концентрации БЭ по показателю оптической плотности образца после ЛАЛ-теста на длине волны λ=388 нм. При этом в реальных анализах и моделирующих экспериментах всегда делается ЛАЛ тест на каждом образце не менее чем в 3 повторностях.

Предварительная подготовка образцов из плазмы крови включает разбавление образцов плазмы крови физиологическим раствором в 10…100 раз и последующую термическую обработку при 45…85°С в течение 30…60 мин. При этом после проведения ЛАЛ-теста в ходе спектрофотометрического определения концентрации БЭ в образцах плазмы крови при помощи термической обработки и разведения возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 0,005 ЕЭ/мл и 0,010 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.

Предварительная подготовка образцов из мочи включает экстракцию мочи при помощи хлорорганического растворителя, включающего, но не ограничивающегося одним из следующих: хлористый метилен, 1,2-дихлорэтан. При этом после проведения ЛАЛ-теста в ходе спектрофотометрического определения концентрации БЭ в образцах мочи при помощи экстракции хлор-органическим растворителем возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 1,00 ЕЭ/мл и 2,00 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.

Идея предлагаемого способа заключается в том, что фермент фактор С, содержащийся в лизате амебоцитов мечехвостов Limulus Amebocyte Lysate (ЛАЛ-реагент), реагирует с БЭ, что запускает каскад ферментативных реакций, приводящий к активации свертывающего фермента. Этот фермент в свою очередь гидролизует особый хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта. Регистрация сигнала происходит спектрофотометрически по изменению оптической плотности (т.е. по интенсивности окраски).

Преимущества предлагаемого способа от найденных аналогов следующие:

1) RU 2325645 - предлагаемый метод является более точным и позволяет количественно определять содержание бактериального эндотоксина в биологических жидкостях, благодаря применению хромогенной модификации ЛАЛ-теста в отличие от визуального контроля, использующегося авторами в данном патенте;

2) JP 761448 (В2) - преимущество предлагаемого способа в большей универсальности, так как в японском методе определяют бактериальный эндотоксин только в крови, тогда как в предлагаемом способе не только в крови и плазме крови, но и в моче, т.е. более широко применимый, универсальный способ;

3) JP 2003232794 (А) - метод, используемый авторами в данном патенте, позволяет проводить определение БЭ в специфичных условиях применения, существенно отличных от признаков предлагаемого способа.

4) CN 1696636 (A) - близкий¹ аналог предварительной обработки образцов крови, включающая в себя обработку раствором тритон Х-100, нагревание-охлаждение и разбавление. Отличие от предлагаемого способа: а) другие концентрации реагента тритон Х-100; б) другие температуры охлаждения; и в предлагаемом способе это разные методики: либо нагревание и разбавление, либо обработка тритон Х-100, с последующей кислотно-щелочной обработкой образцов, тогда как в приведенном патенте все операции необходимо применять к каждому образцу (усложнение), по сравнению с предлагаемым способом требуется больше стадий по предварительные обработки крови. Кроме того, также описывается определение БЭ только в крови (сыворотке крови).

5) WO 2009005231 (А1) - по сравнению с данным методом, из преимуществ предлагаемого способа можно указать, что определение содержания БЭ происходит при помощи хромогенного ЛАЛ-теста, что позволяет использовать любой сравнительно недорогой и доступный лабораторный спектрофотометр.

Примеры осуществление изобретения Примеры 1, 2, 3 - для образцов плазмы крови, примеры 4, 5, 6 -для образцов мочи. Общими приемами для всех примеров являлись проведение реакции подготовленных образцов с ЛАЛ-реактивом и спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах после реакции с ЛАЛ-реактивом.

Пример 1.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Подготовка плазмы

Образцы крови были отцентрифугированы при 1200 g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.

3. Загрязнение плазмы

Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.

4. Обработка образцов

А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 0,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 10 раз.

Б) Пробирки были термостатированы при 45°С в течение 60 минут (при термостатировании их не закрывают).

5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах

Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

7. Результаты анализа

Пробирки с отрицательным контролем (незагрязненная плазма) после часа термсотатирования при 37°С, а также пробирки, содержащие 0,005; 0,0025 ЕЭ/мл остались прозрачными. В пробирках с содержанием бактериального эндотоксина в концентрации 5,00; 0.50. 0,05, 0,01 ЕЭ/мл раствор окрасился в желтый цвет. Оптическая плотность для каждой концентрации при λ=388 нм определялась как среднее значение из трех повторностей (таблица 1).

Таким образом, в плазме крови при помощи термической обработки и разведения возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 0,005 ЕЭ/мл и 0,010 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.

Пример 2.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Подготовка плазмы

Образцы крови были отцентрифугированы при 1200g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.

3. Загрязнение плазмы:

Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5,0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.

4. Обработка образцов

А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 4,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 50 раз.

Б) Пробирки были термостатированы при 60°С в течение 30 минут.

5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах

Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

7. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 1.

Пример 3.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Подготовка плазмы

Образцы крови были отцентрифугированы при 1200g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.

3. Загрязнение плазмы

Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.

4. Обработка образцов

А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 9,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 100 раз.

Б) Пробирки были термостатированы при 85°С в течение 60 минут.

5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

7. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 1.

Пример 4.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Загрязнение мочи:

Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.

3. Обработка образцов.

А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,25 мл хлороформа и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.

Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут. Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.

4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл незагрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

6. Результаты анализа

Пробирки с отрицательным контролем (незагрязненная моча) после часа термсотатирования при 37°С, а также пробирки, содержащие 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл. остались прозрачными. В пробирках с содержанием бактериального эндотоксина в концентрации 5,0; 2,0; 1,0 ЕЭ/мл раствор окрасился в желтый цвет. Оптическая плотность для каждой концентрации при λ=388 нм определялась как среднее значение из трех повторностей (таблица 2).

Таким образом, в моче при помощи экстракции хлор-органическим растворителем возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 1,00 ЕЭ/мл и 2,00 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.

Пример 5.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Загрязнение мочи:

Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.

3. Обработка образцов.

А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,25 мл хлористого метилена и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.

Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут. Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.

4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

6. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 4.

Пример 6.

1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:

Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.

2. Загрязнение мочи:

Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.

3. Обработка образцов.

А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,3 мл 1,2-дихлорэтана и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.

Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.

4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:

В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.

5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.

6. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 4.

Предлагаемый способ разработан и апробирован в рамках выполнения работы по Соглашению №14.577.21.0165 между Министерством образования и науки Российской Федерации (Госзаказчик) и МГТУ им. Н.Э.Баумана.