СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИМЕСЕЙ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА В ГИДРОКСИАПАТИТЕ

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, а именно к способам определения примесей соединений азота, в частности нитратов и нитритов, в гидроксиапатитах (далее ГАП).

Вещества со структурой гидроксиапатита, Са₁₀(РO₄)₆(ОН)₂, входят в состав биологических тканей. Синтезируемый ГАП широко используется как профилактическая составляющая зубных паст и медицинский материал для заполнения костных дефектов, который должен быть полностью биологически совместим с тканями человеческого организма и по химическому составу близок к составу зубной эмали и костной ткани человека [1, 2].

Изобретение может быть использовано для контроля качественного состава природного и синтезируемого ГАП в смысле наличия в них примесей соединений азота в целях увеличения биосовместимости синтезируемого и природного гидроксиапатитов, ведущие к повышению эффективности гигиеническо-профилактических мероприятий и лечения с применением синтетического ГАП.

Для повышения химического и фазового подобия неорганической составляющей костной ткани используют химические модификации ГАП, например Са_10-хNa_x(РO₄)_6-x(СО₃)_x(ОН)₂, карбонизированный гидроксиапатит (далее КГАП), в котором значение индекса x (степень карбонизации) меняется от 0 до 2 [3, 4].

В ряде известных заявителю методик для синтеза ГАП и КГАП используют растворы солей азотной кислоты (нитраты и нитриты) натрия и/или кальция [5, 6]. Было показано [5], что в процессе синтеза гидроксиапатита в коллоидном растворе азотные соединения могут внедряться в кристаллическую структуру гидроксиапатита.

Многочисленные исследования (см., например, [7]) свидетельствуют о токсичности нитратов и нитритов: нитраты в пищеварительном тракте частично восстанавливаются до нитритов (более токсичных соединений), а последние при поступлении в кровь могут вызвать метгемоглобинемию.

Кроме того, из нитритов в присутствии аминов могут образоваться N-нитрозамины, обладающие канцерогенной активностью, что предъявляет повышенные требования к химическому составу гидроксиапатитов как материалов, широко применяемых в лечебно-профилактических целях.

Таким образом, определение примесей азотных соединений в материале, широко применяемом в лечебно-профилактических целях, а также входящем в состав биологических тканей, является актуальной задачей для медико-биологических приложений.

Из исследованного уровня техники заявителю не известны способы (аналоги), сходные с заявленным техническим решение по реализации поставленных задач. При этом заявителю известны способы определения состава содержания нитратов в воде (ГОСТ 22688-77, [8]), нитратов и нитритов в кормах, комбикормах и комбикормовом сырье (ГОСТ 13496.19-93, [9]), методы определения массовых долей нитратов и нитритов в сырах (ГОСТ Р 51460-99, [10]), в казеинах и казеинатах (ГОСТ Р 51454-99, [11]).

Известные заявителю и описанные выше решения основаны на следующих физических принципах и методах: химических, фотометрических и ионометрических, принципиально отличающихся от заявленного технического решения.

Таким образом, приведенные выше способы предназначены исключительно для оценки безопасности продуктов питания для человека и животных, при этом они не могут быть использованы в полной мере для реализации поставленных в заявленном техническом решении задач.

Известен метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) используемый для выявления факта радиационного облучения (детектирования радиационных эффектов) в продуктах питания (мясо и мясные продукты, содержащие костную ткань, [12]), для выявления ряда неорганических радикалов в материалах со структурой гидроксиапатита, возникающих под действием рентгеновского или гамма излучений [13-17].

Приведенные выше способы и методы [8-17] используются для реализации следующих целей:

- для оценки безопасности продуктов питания для человека и животных,

- для выявления ряда неорганических радикалов в материалах со структурой гидроксиапатита, возникающих под действием рентгеновского или гамма излучений, таких как карбонатные, фосфатные и кислородные радикалы.

Основными их недостатками является то, что они не предназначены и не использовались для целей качественного и количественного анализа наличия азотных соединений в веществах со структурой гидроксиапатитов.

Заявленное техническое решение направлено на изучение химического состава гидроксиапатитов, применяемых для проведения медико-биологических исследований и лечебно-профилактических мероприятий с обеспечением возможности улучшения контролируемых показателей данных материалов с целью уменьшения их токсичности и повышения биологической совместимости, в конечном счете, приводящих к повышению эффективности гигиенических и лечебных мероприятий с применением ГАП и КГАП.

При этом заявленное техническое решение обеспечивает реализацию следующих возможностей:

- определение наличия содержания примесей азотных соединений в природных и синтезируемых гидроксиапатитах;

- оценку количественных показателей;

- возможность контроля качественного состава синтезируемых материалов со структурой гидроксиапатита в смысле наличия примесей соединений азота как в процессе синтеза, так и процессе очистки материалов от посторонних включений, что может быть использовано при принятии решения о допустимости использования синтетического ГАП и КГАП в медико-биологических приложениях и позволит давать рекомендации по улучшению технологии производства материалов со структурой гидроксиапатита с целью минимизации токсичности и повышения биологической совместимости с природными материалами, ведущих, в конечном счете, к повышению эффективности гигиенических и лечебных мероприятий с применением гидроксиапатитов.

Заявленный способ определения примесей соединений азота в гидроксиапатите заключается в облучении образца гидроксиапатита рентгеновскими, гамма или электронными лучами с последующей регистрацией спектра ЭПР возникших при облучении парамагнитных центров на сертифицированном ЭПР спектрометре, вычислении спектральных характеристик наблюдаемого спектра ЭПР (число наблюдаемых линий и их положение) с контролем погрешности измерений и сравнении полученных спектральных характеристик с известными спектральными характеристиками азотных радикалов в (поли)кристаллических соединениях [19, 20].

Заявленный способ характеризуется следующей последовательностью этапов:

а) помещение образца гидроксиапатита в стандартную кварцевую ампулу спектрометра ЭПР;

б) облучение образца гидроксиапатита рентгеновскими, гамма или электронными лучами (с соблюдением санитарно-гигиенических норм) при комнатной температуре, доза радиации составляет 10±5 кГр (килогрей);

в) регистрация спектра ЭПР на сертифицированном ЭПР спектрометре, позволяющем проводить измерения в непрерывном или импульсном режимах работы;

г) вычисление параметров спектра ЭПР (число наблюдаемых линий, n, значения компонент g-тензора и тензора сверхтонкого взаимодействия А),

д) контроль погрешности результатов измерений;

е) сравнение полученных параметров с параметрами, известными для азотных радикалов, таких как NO₃ ^2-, в облученных кристаллических матрицах (число наблюдаемых линий, n, значения компонент g-тензора и тензора сверхтонкого взаимодействия А: n=3, g_||=2.005(1), g_⊥=2.009(1), А_||=6.65(20) мТл, А_⊥=3.4(5) мТл).

При этом следует отметить, что изменение последовательности выполнения операций а) и б) не изменяет полученный технический результат.

Достигнутый технический результат заключается в идентификации наличия примесей азотных соединений в ГАП и КГАП на основе регистрации спектров парамагнитных центров, полученных в результате облучения вышеуказанных материалов рентгеновскими, гамма или электронными лучами, методом ЭПР и оценке количества этих центров по измерению амплитуды (интенсивности) составляющих наблюдаемого ЭПР спектра.

Заявителем впервые в составе гидроксиапатита (ГАП) и материалов со структурой, близкой к структуре гидроксиапатита (КГАП), на основе регистрации методом ЭПР были обнаружены парамагнитные центры, которые, по мнению заявителя, обусловлены наличием примесей соединений азота в указанных выше соединениях.

Перечень фигур графических изображений

На Фиг.1. представлены стационарные спектры ЭПР Х-диапазона (на частоте СВЧ 9.6 ГГц, Т=300К) в нанокристаллах КГАП Ca₁₀Na_x(PO₄)_6-х(ОН)₂(СО₃)_x со средними размерами нанокристаллитов 30 нм для различных значения степеней карбонизации в диапазоне х=0-2 мол.%, подвергшихся рентгеновскому облучению с дозой 10 кГр (a-g) и спектр необлученного образца ГАП для сравнения (h). По оси абсцисс отложены значения магнитного поля (в миллитеслах), по оси ординат - амплитуда первой производной сигнала поглощения (в условных единицах). Спектры для разных значений степеней карбонизации x сдвинуты по оси ординат для удобства визуального восприятия.

На Фиг.2 представлены спектры ЭПР, полученные с использованием методики детектирования спинового эха на частоте СВЧ 9.6 ГГц при Т=300К в нанокристаллах КГАП Са₁₀Nа_х(РO₄)_6-x(ОН)₂(СО₃)_x со средними размерами нанокристаллитов 30 нм для различных значения степеней карбонизации в диапазоне х=0-2 мол.%, подвергшихся рентгеновскому облучению с дозой 10 кГр (a-е) и спектр необлученного образца ГАП для сравнения (f). Указаны параллельные и перпендикулярные составляющие значений компонент g-тензора и тензора сверхтонкой структуры А. По оси абсцисс отложены значения магнитного поля (в миллитеслах), по оси ординат - амплитуда сигнала спинового эха (в условных единицах). Спектры для разных значений степеней карбонизации x сдвинуты по оси ординат для удобства визуального восприятия.

Примеры конкретного выполнения

Были получены спектры ЭПР в стационарном режиме спектрометра X-диапазона Bruker Elexsys 580 с рабочей частотой 9,6 ГГц, синтезированных нанокристаллов КГАП Са₁₀Nа_х(РO₄)_6-x(ОН)₂(СО₃)_x с размерами нанокристаллитов 30(5) нм [6] со степенями карбонизации х=0-2 мол.% согласно рекомендациям стандарта [18]. Спектры ЭПР нанокристаллов гидроксиапатита, подвергшихся рентгеновскому облучению с дозой 10(1) кГр, представлены на Фиг.1. Спектры значительно отличаются от спектров ЭПР представленных в многочисленных работах, например [17], по исследованию облученного карбонизированного гидроксиапатита. Для определения природы наблюдаемых новых парамагнитных центров в X-диапазоне была использована методика импульсного ЭПР с детектированием амплитуды первичного электронного спинового эха (Фиг.2).

Спектр ЭПР образцов с x=0 (ГАП) описывается спиновым гамильтонианом аксиальной симметрии [20]:

H=g_||βH_zS_z+g_⊥β(H_xS_x+H_yS_y)+A_||S_zI_z+A_⊥(S_xI_x+S_yI_y),

где S=1/2, I=1; с параметрами гамильтониана g_||=2.005, g_⊥=2.009, A_||=6.65 мТл, A_⊥=3.4 мТл (см. Фиг.2.).

Параметры спинового гамильтониана были определены в предположении, что главные направления тензоров g и А совпадают.

Формы линий спектра ЭПР характерны для спектров порошка и обусловлены усреднением по всем возможным ориентациям парамагнитного центра. Наличие трех линий в спектре объясняется сверхтонким взаимодействием магнитного момента неспаренного электрона парамагнитного центра с магнитным моментом ядра азота со спином I=1.

Параметры наблюдаемого спектра ЭПР (g - тензор, тензор сверхтонкого взаимодействия А, наличие трех линий в спектре) соответствуют характеристикам радикала NO₃ ^2- в облученном кристалле KNO₃ и других кристаллических матрицах [19, 20], характерной особенностью которых является аксиальная симметрия. Такие радикалы впервые наблюдаются в образцах синтетического гидроксиапатита. Наличие NO₃ групп в гидроксиапатите можно объяснить методикой синтеза исследуемых нанокристаллов, при которой исходный раствор содержит компоненты Са(NO₃)₂ и (NH₄)NO₃ [6].

С увеличением степени карбонизации спектр ЭПР трансформируется и происходит значительное уменьшение интенсивности (амплитуды) спектра NО₃, что можно связать с уменьшением внедрения азотных групп в кристаллическую решетку КГАП при увеличении степени карбонизации. Это дает возможность проводить сравнительную количественную оценку содержания азотных соединений для разных образцов путем сравнения амплитуд (интенсивностей) сигналов ЭПР.

Таким образом, заявленное техническое решение позволяет обеспечить достижение поставленных целей, а именно:

- определить качественно и оценить количественно наличие содержания азотных соединений в природных и синтезируемых гидроксиапатитах;

- контролировать качественный состав синтезируемых материалов со структурой гидроксиапатита в смысле наличия примесей соединений азота как в процессе синтеза, так и процессе очистки материалов от посторонних включений, что может быть использовано потребителями при принятии решения о допустимости использования синтетического ГАП в медико-биологических приложениях и позволит давать рекомендации производителям, например, синтетического ГАП и КГАП по улучшению технологии производства материалов со структурой гидроксиапатита с целью минимизации токсичности и повышения биологической совместимости с природными материалами, ведущих, в конечном счете, к повышению эффективности гигиенических и лечебных мероприятий с применением ГАП.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна» предъявляемому к изобретениям, т.к. совокупность заявленных признаков не известна из исследованного заявителем уровня техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень» предъявляемому к изобретениям, т.к. не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленные цели реализованы заявителем в условиях лаборатории спектроскопии ЭПР Казанского (Приволжского) федерального университета.

Источники информации

1. J.P.Lafon, E. Champion and D. Bemache-Assollant, Processing ofAB-type carbonated hydroxyapatite Са_10-x(РO₄)_6-x(СО₃)_x(ОН)_2-x-2y(СО₃)_y, ceramics with controlled composition. J. Eur. Cer. Soc, 28 (1), pp.13 9-147 (2008).

2. R.Z.LeGeros, Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates, Clin. Orthoped. rel. Res, 395 (1), pp.81-98 (2002).

3. I.R.Gibson, W.Bonfield, Novel synthesis and characterization of an AB-type carbonate-substituted hydroxyapatite. J.Biomed. Mater. Res. 59(4), 697-708 (2002).

4. L.G.Ellies, D.G.A.Nelson, J.D.B.Featherstone, Crystallographic structure and surface morphology of sintered carbonated apatites. J.Biomed. Mater. Res. 22 (6), 541-553 (1988).

5. Е.С.Ковалева, М.П.Шабанов, В.И.Путляев, Ю.Д.Третьяков, В.К.Иванов, Н.И.Силкин, Л.Ф.Галиуллина, А.А.Родионов, Г.В.Мамин, С.Б.Орлинский, М.Х.Салахов, Биорезорбитрируемые порошковые материалы на основе Ca_10-xNa_x(PO₄)_6-x(CO₃)_x(OH)₂. Ученые записки КГУ. Серия естественные науки 152 (1), 79-98 (2010).

6. E.S.Kovaleva, M.P.Shabanov, V.I.Putlyaev, Y.D.Tretyakov, V.K.Ivanov, N.I.Silkin, Bioresorbable carbonated hydroxyapatite Ca_10-xNa_x(PO₄)_6-x(CO₃)_x(OH)₂. Cent. Eur. J. Chem. 7(2), 168-174 (2009).

7. Бандман АЛ., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов V-VIII групп. Справочное издание. Под ред. В.А.Филова и др. Л.: Химия, 1989, 592 с.

8. ГОСТ 18826-73 Вода питьевая. Методы определения содержания нитратов.

9. ГОСТ 13496.19-93 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания нитратов и нитритов.

10. ГОСТ Р 51460-99 Сыр. Метод определения массовых долей нитратов и нитритов.

11. ГОСТ Р 51454-99 - Казенны и казеинаты. Метод определения массовых долей нитратов и нитритов.

12. ГОСТ Р 52529-2006 Мясо и мясные продукты. Метод электронного парамагнитного резонанса для выявления радиационно-обработанных мяса и мясопродуктов, содержащих костную ткань.

13. М.Mengeot, R.H.Bartram, O.R.Gilliam, Paramagnetic holelike defect in irradiated calcium hydroxyapatite single crystals. Phys. Rev. В 11 (11), pp.4110-4124(1975).

14. F. Callens, G. Vanhaelewyn, P. Matthys, E. Boesman, EPR of Carbonate Derived Radicals: Applications in. Dosimetry, Dating and Detection of Irradiated Food. Applied magnetic resonance, 14 (2), pp.235-254 (1998)

15. P.Moens, F.Callens, S.V.Doorslaer, P.Matthys, ENDOR study of an O-ion observed in x-ray-irradiated carbonated hydroxyapatite powders. Phys. Rev. В 53 (11), pp.5190-5197 (1996).

16. D.U.Schramm, J.Terra, A.M.Rossi, D.E.Ellis. Configuration of СО₂ ^- radicals in gamma-irradiated A-type carbonated apatites: theory and experimental EPR and ENDOR studies Phys. Rev. B, 63, pp.024107-024133, (2000).

17. D.U.Schram, A.M.Rossi. Electron spin resonance (ESR) studies of CO₂ ^- radicals in irradiated A and B-type carbonate-containing apatites Applied radiation and isotopes, 52, pp.1085-1091 (2000).

18. ГОСТ Р 22.3.04-95 Безопасность в чрезвычайных ситуациях контроля населения. Дозиметрический метод определения поглощенных доз внешнего гамма излучения по спектрам электронного парамагнитного резонанса зубной эмали.

19. P.W.Aktins, M.C.R.Symons. The structure of inorganic radicals. An application of electron spin resonance to the study of molecular structure Amsterdam: Elsevier publishing company, 1967.

20. J.A.Weil, J.R.Bolton. Electron Paramagnetic Resonance: Elementary Theory and Practical Applications, 2nd Edition. J.Wiley, 2007. ISBN 978-0471754961.