Способ стимулирования ангиогенеза с использованием генетически модифицированных клеток крови пуповины

Изобретение относится к медицине, касается стимулирования ангиогенеза и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии для лечения ишемии с использованием генно-клеточного материала.

В настоящее время ишемия, в частности хроническая ишемия нижних конечностей, лечится медикаментозным и оперативным путем, однако ни один из применяемых в практической медицине методов в полной мере не устраняет основную причину и не приводит к полному восстановлению микроциркуляции пораженной ткани. Так, по мнению ряда авторов, улучшение гемодинамики конечности хирургическим путем, возможна лишь в 70% всех случаев [Савельев, 1997].

Известно, что существуют способы введения ангиогенных генов для стимулирования ангиогенеза. Основу лечебной тактики ангиогенеза, предложенной М. в 1993 г. [. М., Schlenger К., Doctrow S. Therapeutic angiogenesis. Arch. Surg. 1993; 128: 423-9.], составляет стимулирование ангиогенеза в ишемизированных тканях под действием ангиогенных факторов роста, например при помощи VEGF. Данный ген можно вводить при помощи аденовируса (Ad VEGF) в виде инъекции в мышечную ткань, испытывающую ишемию, в виде прямой генной терапии. Согласно данным литературы, в условиях прямой генной терапии показано улучшение структуры и функции ишемизированной мышцы [Jazwa A, Tomczyk М, Taha НМ, Hytonen Е, Stoszko М, Zentilin L, Giacca М, Yla-Herttuala S, Emanueli С, Jozkowicz A, Dulak J. Arteriogenic therapy based on simultaneous delivery of VEGF-A and FGF4 genes improves the recovery from acute limb ischemia. Vascular Cell 2013, 5:13. doi: 10.1186/2045-824X-5-13.; Sanada F, Taniyama Y, Azuma J, Yuka I, Kanbara Y, Iwabayashi M, Rakugi H, Morishita R. Therapeutic Angiogenesis by Gene Therapy for Critical Limb Ischemia: Choice of Biological Agent. Immunol Endocr Metab Agents Med Chem. 2014; 14 (1): 32-39].

Известен способ введения комбинации генов в поврежденную нервную ткань. (Патент РФ C12N 15/79 (2006.01) №2459630) путем доставки в область повреждения спинного мозга прямым введением плазмидного вектора на основе двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей комбинацию клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов человека VEGF и FGF2). Однако этот способ имеет отношение к восстановлению нервной ткани, и не используется для стимулирования ангиогенеза.

Более близких аналогов к заявляемому изобретению обнаружено не было. Обнаруженные изобретения касаются восстановления функции нервной ткани.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа, который бы давал возможность эффективного стимулирования ангиогенеза для формирования нового сосудистого русла.

Поставленная задача решается предлагаемым способом стимулирования ангиогенеза путем введения трансдуцированных Ad VEGF + Ad Ang мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) в область ишемии.

Данные клетки вводят в область ишемии в объеме 0,2 мл клеток, с трансдуцированными генами VEGF + ANG, с общим количеством вирусных частиц в объеме 2×10¹⁰.

Заявляемый способ иллюстрируется следующими исследованиями: Данное исследование проводили на 30 особях крыс мужского пола линии Wistar массой 220-280 г. Все вмешательства соответствовали правилам, утвержденным локальным этическим комитетом при Казанском государственном медицинском университете. Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°C со свободным доступом к воде и пище. Хирургические манипуляции на крысах проводили после их наркотизирования путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Ишемию задней конечности создавали путем наложения на бедренную артерию сразу у места отхождения от подвздошной артерии двух лигатур, которые плотно затягивали. Участок между лигатурами резецировали. После операции животные получали инъекцию 1 мл разведенного в физиологическом растворе антибиотика гентамицина в мышцу бедра на неоперированной ноге с целью профилактики послеоперационных инфекционных осложнений. Сразу после создания ишемии крысы получали трансдуцированные Ad VEGF + Ad Ang МККП, в объеме 60 мкл, в 4 точки в дистальную часть икроножной мышцы оперированной конечности, по 15 мкл в каждую точку, общая концентрация вирусных частиц, кодирующих VEGF и Ang 2×10¹⁰.

Примеры выполнения способа. Перед оперативным вмешательством животное наркотизировали внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Операционное поле в области медиальной части голени и бедра очищали от шерсти. Ишемию задней конечности создавали путем наложения на бедренную артерию сразу у места отхождения от подвздошной артерии двух лигатур, которые плотно затягивали. Участок между лигатурами резецировали. После операции животные получали инъекцию 1 мл разведенного в физиологическом растворе антибиотика гентамицина в мышцу бедра на неоперированной ноге с целью профилактики послеоперационных инфекционных осложнений. Сразу после оперативного вмешательства после зашивания кожи крысы получали трансдуцированные Ad VEGF + Ad Ang МККП, в объеме 60 мкл, в 4 точки в дистальную часть икроножной мышцы оперированной конечности, по 15 мкл в каждую точку, общая концентрация вирусных частиц, кодирующих VEGF и Ang 2×10¹⁰. Результаты работы были оценены по количеству и среднему размеру эндотелиальных клеток, выявляемых на продольных срезах при помощи антител против CD31 и CD34- иммунопозитивных клеток, позволяющие идентифицировать эндотелиальные клетки как маркеры ангиогенеза. По сравнению с контрольной группой животных, получавших 60 мкл NaCl в дистальную часть икроножной мышцы в том же объеме и в те же точки, зарегистрировали значительное увеличение как количества эндотелиальных клеток, так и их размеров. Полученные данные позволяют утверждать, что у животных из группы Ad VEGF + Ad ANG МККП, произошли такие процессы как гипертрофия и гиперплазия эндотелиальных клеток, что можно трактовать как усиление ангиогенеза.

По сравнению с прямой генной терапией, предполагающей непосредственную инъекцию ДНК-содержащих векторов в организм, клеточно-опосредованная доставка терапевтических генов имеет очевидные преимущества. Главное из них, основанное на феномене адресной миграции клеток (хоуминг), состоит в потенциальной возможности обеспечить доставку генов к множественным очагам ишемии, наличие которых характерно для проявления большинства ишемических заболеваний. Другое преимущество генно-клеточной терапии связано с возможностью длительной продукции в области повреждения молекул стимуляторов регенерации в оптимальных дозах. Наконец, сами трансплантируемые клетки служат источником молекул-стимуляторов регенерации и молекул внеклеточного матрикса, поддерживающих рост новых сосудов.

Авторами впервые исследована и показана возможность эффективного стимулирования ангиогенеза для формирования нового сосудистого русла, что позволит эффективнее лечить такие заболевания как ишемия нижних конечностей, а так же в перспективе большинство сосудистых заболеваний, связанных со стенозом или окклюзией артериального русла вследствие атеросклероза- ишемическая болезнь сердца, хроническая ишемия головного мозга, путем создания нового коллатерального русла, или биологического шунтирования, основанного на применении генно-модифицированных стволовых клеток.