Способ оценки повреждающего действия цитомегаловирусной инфекции на содержание миристиновой кислоты в крови пуповины новорожденных от матерей, перенесших в третьем триместре реактивацию цитомегаловирусной инфекции

Область применения: изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, а также к области научных исследований - патологической физиологии, и предназначено для оценки угрозы развития гипоксии новорожденных при реактивации цитомегаловирусной инфекции у матери в третьем триместре.

Уровень техники

Основными структурными компонентами клеток наряду с белками являются фосфолипиды и входящие в их состав жирные кислоты, которые обеспечивают целостность морфологической структуры эритроцита и прочно удерживаются эритроцитарной мембраной. Однако, даже незначительные структурные перераспределения, приводящие к ассиметрии мембранных фосфолипидов клетками, в значительной степени могут сказаться на нарушении функций биомембран, ее проницаемости, пластичности, вязкоэластических свойствах, что влечет за собой снижение стабильности мембран клеток крови и тканей [5, 6].

Текучесть или микровязкость является интегральным показателем, зависящим от нескольких компонентов: ненасыщенности липидов, содержания холестерина в мембране, фосфолипидного состава и количества белка введенного в мембрану [1, 2]. Важное значение в изменении структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов придают увеличению количества сфингомиелина и насыщенных жирных кислот.

Чрезмерное накопление миристиновой кислоты приводит к уплотнению липидного бислоя мембран эритроцитов, что отражается на функциональных свойствах мембраны, а именно относительной микровязкости [3, 4].

В результате увеличения микровязкости мембран, эритроциты утрачивают эластичность, теряют способность к изменению формы, необходимой для прохождения по микрососудам, что приводит к усиленному их разрушению в сосудистом русле, создавая, тем самым, условия для развития гипоксии.

Известны способы прогнозирования гипоксии плода по определению в венозной крови беременных в третьем триместре и перед родами свободных аминокислот [10], содержания молекул средней массы в биосубстратах (сыворотка крови и моча) при нормальной и осложненной беременности у женщин и новорожденных [9], уровня содержания провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей α и интерлейкина-4 в сыворотке крови у беременных в третьем триместре [11], по изучению жирно-кислотного состава конденсата выдыхаемого воздуха у беременных женщин [12], концентрации фактора некроза опухолей α в сыворотке крови и мембране эритроцитов полиненасыщенных жирных кислот [7, 8].

Основным недостатком данных способов является:

- не применимы для оценки угрозы развития гипоксии новорожденных при реактивации цитомегаловирусной инфекции у матери в третьем триместре.

Указанный недостаток может быть устранен в заявленном способе.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является повышение точности оценки развития гипоксии новорожденных при реактивации цитомегаловирусной инфекции у матери в третьем триместре.

Осуществление изобретения

Исследована кровь пуповины 25 новорожденных от женщин с реактивацией цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности и 20 новорожденных от женщин с латентным течением цитомегаловирусной инфекции в период беременности. Симптоматически цитомегаловирусная инфекция у беременных в третьем триместре беременности проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - реактивация хронической цитомегаловирусной инфекции - устанавливали при комплексном исследовании периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса, уровня антител иммуноглобулина класса М или четырехкратного и более нарастания титра антител иммуноглобулина класса G в парных сыворотках в динамике через 10 дней, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №226.

Определение типоспецифических антител иммуноглобулинов класса М и G к цитомегаловирусу, индекса авидности осуществляли методами иммуноферментного анализа на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

Содержание миристиновой кислоты в мембране эритроцитов крови пуповины у новорожденных определяли методом газожидкостной хроматографии. Кровь забирали из артерии пуповины в стандартную пробирку с антикоагулянтом.

Липиды из крови пуповины экстрагировали по методу Folch [14] смесью хлороформ - метанол (2:1). Полученный экстракт упаривали в токе воздуха досуха. К экстракту липидов добавляли порциями 5 мл ацетона и оставляли на ночь при t 3-5°С. Полученный осадок центрифугировали и проводили метилирование жирных кислот [13].

Полученный метиловый эфир миристиновой кислоты анализировали на газовом хроматографе «Кристалл 2000м» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Обсчет и идентификацию пиков выполняли с помощью программно-аппаратного комплекса «Хроматэк Аналитик 2,5» по временам удерживания с использованием стандартов фирмы «Supelco» (США). Количественный расчет хроматограмм проводили методом внутренней нормализации путем определения площадей пиков анализируемых компонентов и их доли (в относительных %) в общей сумме площадей пиков метилированых продуктов высших жирных кислот.

Измерение микровязкости мембран эритроцитов проводили методом латеральной диффузии гидрофобного флуоресцентного зонда пирена [1]. Определение микровязкости основано на образовании эксимеров (активных димеров) пирена в липидном окружении. Флуоресценцию пирена измеряли на спектрофлюориметре «Hitachi». Для определения микровязкости липидного бислоя находили интенсивность флуоресценции или свечение пирена при длине волны возбуждения 334 нм, длина волны мономеров 395 нм, длина волны эксимеров 470 нм. Оценка микровязкости основана на вычислении коэффициента эксимеризации пирена (К_экс.=F₄₇₀/F₃₉₅), который равен отношению интенсивности флуоресценции эксимеров к интенсивности флуоресценции мономеров. Коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от микровязкости.

ОБследование новорожденных от женщин с реактивацией цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности при выявлении титра антител иммуноглобулина класса G к цитомегаловирусу 1:1600 показали повышение содержания миристиновой кислоты в мембране эритроцитов крови пуповины до 1,64±0,007% (контроль - 1,24±0,008%), увеличение микровязкости липидного бислоя и снижение коэффициента эксимеризации пирена до 0,48±0,004 Fэ/Fм (контроль - 0,76±0,005 Fэ/Fм), что создает угрозу развития гипоксии новорожденного ребенка.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать угрозу развития гипоксии новорожденного ребенка по уровню антител иммуноглобулина класса G в сыворотке крови пуповины, содержанию миристиновой кислоты и микровязкости липидного бислоя в мембране эритроцитов. Ранее совокупность указанных признаков в оценке угрозы развития гипоксии у новорожденного ребенка при реактивации цитомегаловирусной инфекции у женщин в третьем триместре беременности не использовалась.

Сущность заявленного способа поясняется следующим примером.

Пример. Больная С. Возраст 22 года. Реактивация хронической цитомегаловирусной инфекции с титром антител иммуноглобулина класса G к цитомегаловирусу 1:1600 на 34 неделе беременности.

После родов произведен забор крови из артерии пуповины новорожденного ребенка. По заявленному способу содержание миристиновой кислоты в мембране эритроцитов крови пуповины новорожденного составило 1,32%, коэффициент эксимеризации пирена - 0,51 Fэ/Fм.

Следовательно, можно констатировать, что ребенок, родившейся от больной С., находится в группе риска по развитию гипоксии.

Используемые источники

1. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989. С. 191-206.

2. Ишутина Н.А. Зависимость микровязкости мембран эритроцитов от фосфолипидного состава при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2008. №28. С. 25-28.

3. Ишутина Н.А., Луценко М.Т., Дорофиенко Н.Н. Миристиновая, пальмитиновая и стеариновая жирные кислоты в периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2017. №63. С. 47-52.

4. Лескова Г.Ф. Особенности воздействия перфторана на структурно-метаболические нарушения в печени при экспериментальном атеросклерозе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136, №10. С. 386-389.

5. Пат. 2390020 РФ Способ определения уплотненных белково-липидных участков в мембранах эритроцитов различной степени зрелости с помощью компьютерной программы Biovision / М.Т. Луценко; опубл. 20.02.2010

6. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина Н.А. Кислородтранспортная функция крови у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции // Вестник Российской Академии медицинских наук. 2012. №6. С. 66-72.

7. Пат. 2513456 РФ Способ диагностики стабильности эритроцитов у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции / М.Т. Луценко, И.А. Андриевская, Н.А. Ишутина; опубл. 20.04.2014.

8. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина Н.А., Мироненко А.Г. Механизмы формирования гипоксии плода в период беременности и нарушения кровоснабжения плода при цитомегаловирусной инфекции // Вестник Российской Академии медицинских наук. 2015. №1. С. 106-112.

9. Пат. 2148256 РФ Способ доклинического прогнозирования плацентарной недостаточности / И.В. Смиренина, Т.Ю. Пестрикова; опубл. 27.04.2000.

10. Пат. 2334985 РФ Способ прогнозирования развития внутриутробной гипоксии плода / А.Э. Тарханова, Л.А. Ковальчук, В.Н. Прохоров; опубл. 27.09.2008.

11. Пат. 24575 Республика Казахстан Способ диагностики внутриутробной гипоксии плода / Ж.А. Утешева, Н.М. Мамедова, Л.С. Дзоз, Н.В. Кравцова; опубл. 15.09.2011.

12. Пат. 2131126 РФ Способ пренатальной диагностики хронической гипоксии плода / Б.С. Хышиктуев, Н.А. Хышиктуева, В.Н. Иванов; опубл. 27.05.1999.

13. Carren J.P., Dubacy J.P-J. Adaptation of a micro-seale metod to the micro-seale for fatty acid methyl trausestenif: cation of biological lipid extracts // Chromatography. 1978. Vol. 151. P. 384-390.

14. Folch J., Lees M., Sloane G.H. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animals tissues // J. Biol. Chem. 1957.Vol. 226. P. 497-509.