СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ КАРБОАНГИДРАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ

Изобретение относится к области медицины, а именно к проблеме создания новых способов диагностики угрозы формирования гемической гипоксии при цитомегаловирусной инфекции у беременных.

Карбоангидраза - фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации диоксида углерода: [3, 4]. Фермент обнаружен в эритроцитах, в поджелудочной и слюнной железе, в слизистой желудка, в почках, в ткани центральной нервной системы, в сетчатке глаза и во многих других местах организма. Имеются сведения об ее участии в управлении переносом дыхательных газов, в регуляции pH, в управлении реакциями биосинтеза с участием бикарбоната (глюконеогенез, синтез аминокислот, липогенез), в регуляции обновления костной ткани, в регуляции образования мочи, в реакциях, обеспечивающих образование соляной кислоты в железах желудка, бикарбонатов в соке поджелудочной железы, в слюне, в образовании цереброспинальной жидкости и во многих других процессах в организме.

Карбоангидраза эритроцитов ускоряет реакцию гидратации двуокиси углерода в цитоплазме эритроцита в 1500-2000 раз по сравнению с аналогичной реакцией, протекающей в плазме крови, не содержащей карбоангидразы. Карбоангидраза в зависимости от напряжения двуокиси углерода, pCO₂ в среде, от ряда других факторов может ускорять реакцию гидратации молекул двуокиси углерода с образованием угольной кислоты и бикарбонатных ионов. Гемоглобин присоединяет положительно заряженный ион водорода - по два протона на каждые 4 освободившиеся молекулы кислорода, что способствует поддержанию буферных свойств крови.

В капиллярах микроциркуляторного русла легких кислород, наоборот, присоединяется к молекуле дезоксигемоглобина. Водород же присоединяется к бикарбонату, образуя угольную кислоту, которая диссоциирует на воду и углекислый газ. Это приводит к высвобождению двуокиси углерода из крови в альвеолярную смесь газов. В тканях при снижении pH гемоглобин легко отдает кислород. Это обратимое явление и есть эффект Бора, который характерен только для гемоглобина [2, 5, 6, 7].

Активность карбоангидразы в крови в норме довольно постоянна, но при некоторых патологических состояниях она значительно изменяется. Повышение активности карбоангидразы в крови отмечают при анемиях различного генеза, нарушениях кровообращения II-III степени, некоторых заболеваниях легких (бронхоэктазах, пневмосклерозе), а также при беременности. Снижение активности этого фермента в крови происходит при ацидозе почечного генеза, гипертиреозе. При внутрисосудистом гемолизе активность карбоангидразы появляется в моче, в то время как в норме она отсутствует. Поэтому контролировать активность карбоангидразы в крови целесообразно, так как она может служить критерием адаптивных возможностей организма при различного рода патологических состояниях.

Вместе с тем, проблема определения угрозы формирования гемической гипоксии при цитомегаловирусной инфекции у беременных до настоящего времени остается не решенной.

Для определения активности карбоангидразы в настоящее время применяют радиологические, иммуноэлектрофоретические, колориметрические и титриметрические методы. Определение производят в цельной крови, взятой с гепарином, или в гемолизированных эритроцитах. Для клинических целей используют колориметрические методы определения активности карбоангидразы (например, модификации метода Бринкмана), основанные на установлении времени, необходимого для сдвига pH инкубационной смеси с 9,0 до 6,3 в результате гидратации CO₂ [1].

Существенным недостатком известного способа является достаточно низкая чувствительность, наличие дорогостоящего оборудования и условий для выполнения методики.

Новая техническая задача - разработка способа оценки угрозы формирования гемической гипоксии в зависимости от активности карбоангидразы в эритроцитах периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения.

В настоящем изобретении рассматривается возможность применения гистохимического метода, что позволит повысить точность функциональной и количественной оценки продуктов реакции на карбоангидразу в нативных эритроцитах, а следовательно, своевременно на доклинитческом уровне определять угрозу формирования гемической гипоксии у беременных при цитомегаловирусной инфекции.

Заявленный способ имеет следующие приемы.

1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН. Обследовано 25 беременных при сроке гестации 8-9 недель в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без таковой патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение цитомегаловирусной инфекции - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также ДНК цитомегаловируса. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

2. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител класса IgM и IgG, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК цитомегаловируса методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

3. Карбоангидразу в эритроцитах периферической крови выявляли гистохимическим методом. Суть метода заключалась в инкубации 1 мл цельной крови, взятой утром натощак из локтевой вены в стандартизованные вакуумные пробирки (PUTH, К3 ЭДТА), с 2 мл свежеприготовленного и профильтрованного раствора субстрата, состоящего из 5 мл 8% NaHCO₃ и 1 мл 10% CoCl₂. Эритроциты инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 минут. Для отделения надосадочной жидкости кровь откручивали при 1500 g в течение 1-2 минут. Супернатант удаляли декантированием. Эритроциты отмывали 2 раза бикарбонатным буфером (pH 7,2-7,4) с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 1-2 минут. К отмытым и открученным эритроцитам добавляли 1 мл 2% раствор сульфида аммония или натрия. Инкубировали в течение 2 минут. Эритроциты отмывали 2 раза бикарбонатным буфером (pH 7,2-7,4) с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 1-2 минут. После чего готовили монослойный мазок на центрифуге «Diffe Spin-2» (USA). Полученные мазки высушивали и изучали при иммерсии под цифровым микроскопом МТ (Япония), который связан с программно-аппаратным комплексом «SCION Corporation» (USA), позволяющим выделять на изображении с мазка каждую клетку в отдельности и после выделения клетки определять ее площадь с выявленным продуктом реакции на карбоангидразу. При этом автоматически выдавался показатель плотности в пикселях в зависимости от интенсивности реакции на карбоангидразу, которую принимали за условные единицы измерения (усл.ед.).

4. Статистическую обработку данных осуществляли по критерию Манна-Уитни, гипотезу о статистической значимости различий двух выборок - с помощью t критерия Стьюдента. Значения считали достоверными при p<0.05.

Исследования показали, что при обострении цитомегаловирусной инфекции при сроке 8-9 недель, которое характеризовалось наличием IgM к цитомегаловирусу, титром антител IgG 1:1600, индекса авидности 87% и маркера репликации вируса ДНК цитомегаловируса в соскобе цервикального канала, в периферической крови беременных определялось снижение числа эритроцитов до 65,0±2,2%, имеющих реакцию на карбоангидразу в пределах значений 0,015±0,002 усл.ед. (фиг.1) при контроле 0,059±0,004 усл.ед., приходящихся на 85,0±3,2% эритроцитов (фиг.2). При этом количество оксигемоглобина в эритроцитах периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией снижалось до 95,0±1,5% при контроле 99,0±1,0%.

Таким образом, обострение цитомегаловирусной инфекции сопровождается подавлением активности карбоангидразы в эритроцитах периферической крови беременных, что приводит к снижению интенсивности процессов оксигенации гемоглобина и угрозе формирования гемической гипоксии.

Литература

1. Андриевская И.А. Характер дыхательной активности крови у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Фундаментальные аспекты оценки фетоплацентарной недостаточности при вирусных заболеваниях во время беременности. Благовещенск: Изд-во АМГУ, 2008. С.54-72.

2. Воробьев Л.И. Руководство по гематологии. М.: Ньюдиамед, 2007. 275 с.

3. Тиц Н.У. Клиническая оценка лабораторных тестов. М., 1986. 196 с.

4. Медицинская энциклопедия. 1991-1992.

5. Coburn R., Williams W., White P., Kahn S.B. The production of carbon monoxide from hemoglobin in vivo. J. Clin. Invest., 1967; 46: 346-356.

6. White P., Coburn R., Williams W. Carbon monooxide production associated with ineffective erythropoiesis. J. Clin. Invest., 1967; 46(12): 1986-1998.

7. Stevenson O.R., Vreman H.J. Carbon monooxide and bilirubin production in neonates. Pediatrics, 1997; 100: 252-254.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на карбоангидразу в эритроцитах периферической крови беременных при сроке 8-9 недель и обострении цитомегаловирусной инфекции (титр 1:1600). Показатели интенсивности продуктов реакции на карбоангидразу - 0,015±0,002 усл.ед. Количество эритроцитов, проявляющих реакцию на карбоангидразу, - 65,0±2,2%.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на карбоангидразу в эритроцитах периферической крови практически здоровых беременных, серонегативных в отношении цитомегаловируса, при сроке 8-9 недель. Показатели интенсивности продуктов реакции на карбоангидразу - 0,059±0,004 усл.ед. Количество эритроцитов, проявляющих реакцию на карбоангидразу, - 85,0±3,2%.