Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ STREPTOMYCES TSUKUBENSIS - ПРОДУЦЕНТ ТАКРОЛИМУСА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКРОЛИМУСА

Штамм Streptomyces tsukubensis - продуцент такролимуса и способ получения такролимуса

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения фармацевтической субстанции биологически активного соединения - такролимуса на основе нового высокопродуктивного штамма для использования в качестве иммунодепрессанта.

Такролимус относится к иммунодепрессантам группы природных азотсодержащих макролидов с эмпирической формулой C₄₄H₆₉NO₁₂ (фиг.). Основой химической структуры препарата является 23 членное-лактонное макроциклическое кольцо, к которому присоеденены атомы углерода.

Такролимус продуцируется актиномицетом Streptomyces tsukubaensis. Открыт в 1984 году в Японии группой Т. Goto, Т. Kino и Н. Hatanaka.

Такролимус является высокоактивным иммунодепрессивным препаратом: подавляет формирование цитотоксических лимфоцитов, которые, в основном, отвечают за отторжение трансплантата, снижает активацию Т-клеток.

Многолетняя клиническая практика применения препарата показала, что такролимус обеспечивает надежную профилактику острого отторжения трансплантата, в том числе резистентного к терапии кортикостероидами. Некоторые результаты клинических исследований указывают на то, что такролимус способен снизить частоту хронического отторжения, а также риск сердечно - сосудистых заболеваний, которые являются основными причинами утраты трансплантата на сроках более 1 года после трансплантации.

Такролимус, как и другие макролидные антибиотики, проявляет антибактериальную активность в отношении различных бактерий, дрожжей и грибов, ингибируя их рост [High K.Р. Am. J. Transplant. 1994, v. 57, p. 1689-1700; Wong G.K., Grifith S., Kojima I., Demain A.L. J. Antibiot. 1998. v. 51, p. 487-491.

Такролимус эффективен при лечении атипичных дерматитов: псориаза, гангренозной пиодермии и др., при лечении гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунных болезней: ревматоидного артрита, красной волчанки и др. [Yocum D.E. Rheum. Dis. Clin. North Am. 1996. v. 22(1), p. 133-154; Hananaka H., Shimomura K., Nihon yakurigaku zasshi. 1997, 110 Suppl. 1, p. 69-71; SOO K.H., Park Y.J. Microbiol. Biotechnol. 2007, v. 17(10), p. 1638-1644; Nighiem P., Pearson G., Langley R.G. J. Am. Acad. Dermatol. 2002, v. 46, p. 228-241; US 4,894,366, 1990; WO 2005/063963 A1, 2005].

Такролимус обладает активностью против вируса ветряной оспы, возможно, воздействуя на репликацию ДНК при заражении ортопоксвирусом [Reis SA., Moussatche N., Damaso CR. J. Appl. Microbiol. 2006, v. 100(6), p. 1373-1380].

Несмотря на широкий спектр возможностей применения такролимуса в медицине, его использование в значительной мере ограничивается тем, что существующие природные штаммы-продуценты не отличаются высокой продуктивностью, что увеличивает себестоимость субстанции и снижает возможные объемы ее промышленного производства.

Продуктивность существующих в настоящее время промышленных штаммов колеблется в широких пределах 60-980 мг/л. (US 5624842, 1997, Kim H.S., Park.Y.I. J. Biosci. Bioeng. 2008, v. 105, N.4, p. 418-421, US 5194378) и не является достаточной для промышленного производства. Таким образом, проблема разработки высокопродуктивных штаммов и технологий биосинтеза такролимуса остается актуальной.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения препарата, описанный в патенте RU 2495937.

Патент раскрывает способ получения такролимуса с использованием штамма Streptomyces sp. МТ246 (ВКМ Ас-2618Д) и специально подобранной питательной среды с дробной подачей источника углерода. В качестве дополнительного источника углерода используют рамнозу, в качестве необходимого компонента среды - MnSO₄ и процесс проводят в присутствии сорбента, в качестве сорбента используют нейтральные амберлиты - ХАД.

Подпитку проводят дробно на 4-7 сутки культивирования, используя растворимый крахмал.

Процесс характеризуется активным накоплением такролимуса, титр которого на 10 сутки культивирования достигает достаточно высоких значений (980 мг/л), но не является достаточным для промышленного производства (экономическая целесообразность использования такого процесса крайне низка), что является существенным недостатком данного способа.

Целью предлагаемого изобретения является получение нового высокопродуктивного штамма-продуцента такролимуса и выбор условий его культивирования, обеспечивающих высокий выход конечного продукта, а также разработка способа выделения и очистки антибиотика, пригодных для создания технологии промышленного получения препарата.

Цель достигается созданием нового высокопродуктивного штамма Streptomyces tsukubensis IF-51-19, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ Ac-2797D, подбором условий культивирования, обеспечивающих высокий выход конечного продукта (1100-1300 мг/л), а также созданием промышленного способа выделения и очистки антибиотика из культуральной жидкости, включающего применение смол-сорбентов с получением субстанции такролимуса фармацевтического качества.

На первом этапе был получен новый штамм - продуцент такролимуса Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D.

Исходя из литературных данных, предпочтительным способом получения штамма продуцента такролимуса является многостадийный индуцированный мутагенез в комбинации с селективным отбором. В качестве мутагена применяется УФ облучение, использование которого не требует наличия сложного оборудования и отличается простотой.

Новый штамм получен путем ненаправленного индуцированного многоступенчатого УФ-мутагенеза и последующей селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора изолятов исходного штамма St. tsukubensis DSM 42081, продуктивность которого составляла 100 мг/л такролимуса. В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны 280 нм (лампа Mineralight, мощность 12,5 Вт). Водную суспензию спор помещали на расстоянии 40 см от лампы, при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см². Высокопродуктивный штамм был выделен после облучения исходной культуры в течение 7 минут.

Продуктивность нового штамма Streptomyces tsukubensis IF-51-19 определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Полученный новый штамм Streptomyces tsukubensis IF-51-19, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2797D.

Штамм Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D обладает повышенной продуктивностью такролимуса в колбах (750±25) мг/л.

Идентификация штамма. Для генетической идентификации полученного штамма ВКМ Ac-2797D было проведено секвенирование исходного и полученного штаммов. Была определена практически полная последовательность (1479 нуклеотидов) амплификата гена, кодирующего 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов для обоих образцов оказались идентичными между собой.

Последовательность гена 16S рРНК полученного мутантного штамма и исходного штамма на 99% совпадает с аналогичной последовательностью штамма Streptomyces tsukubaensis 9993 на всем протяжении, поддающемся достоверной расшифровке.

Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D.

Морфологические признаки. Образует округлые колонии, воздушный мицелий розового цвета, споры черные, гладкие, профиль колонии плоский, вросший в агар, структура однородная, размер колоний 3-4 мм.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (26±1)°С, оптимум роста 26°С в диапазоне значений рН (6.8-7.0). Глюкозу инвертирует. Использование источников углерода. В отличие от исходного штамма, хорошо утилизирует в высоких концентрациях такие источники углерода, как глюкоза и глицерин.

Антагонистические свойства активен in vitro в отношении грамположительных кокков (стрепто- и стафилококков) и грамположительных палочек, включая Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium spp. и Listeria monocytogenes. Кроме того, такролимус проявляет активность в отношении грамотрицательных кокков (Neisseria spp.), эффективен в отношении микоплазм и уреаплазм.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Агаризованная питательная среда

Для поддержания, хранения и приготовления посевного материала культуры используется агаризованная среда состава (г/л): агар-агар - 22, соевая мука - 1, дрожжевой экстракт - 5, глицерин - 20, карбонат кальция - 1, солевой раствор - 100 мкл:*(*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; CuCl₂⋅2H₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 7.0±0.1

Вегетативная питательная среда

Приготовление посевного материала осуществляется на вегетативной среде следующего состава:

*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84

Ферментационная питательная среда

*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0,24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0,42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0,02; ZnSO₄ - 0,84.

Хранение культуры

Штамм-продуцент субстанции такролимус Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D может храниться в сублимационно высушенном состоянии в ампулах при температуре (4±2)°С не менее трех лет или при температуре от -20°С до -80°С в форме 25% суспензии в глицерине в течение одного года без потери жизнеспособности и способности к биосинтезу субстанции такролимус.

Поддержание культуры

Культуру продуцента такролимуса Streptomyces tsukubensis ВКМ Ас-2797D поддерживают на агаризованной среде состава (г/л): агар-агар - 22, соевая мука - 1, дрожжевой экстракт - 5, глицерин - 20, карбонат кальция - 1, солевой раствор* - 100 мкл: (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворимый крахмал - 10, сульфат магния - 1, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 7.0±0.1.

Для поддержания уровня продуктивности культуры, перед каждым пересевом ее на свежие питательные среды, проводят моноспоровый рассев на чашки Петри.

Выращивание культуры продуцента в чашках Петри проводят в течение 5-7 суток при температуре 28±0.1°С.

Таким образом, создан новый штамм Streptomyces tsukubensis ВКМ Ас-2797D обладающий повышенной продуктивностью такролимуса в колбах (750±25) мг/л, отличающийся от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (глюкоза, глицерин), по антагонистическим свойствам.

Следующим этапом работы было дальнейшее повышение продуктивности штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D путем оптимизации состава питательной среды.

Для того, чтобы выяснить какие компоненты питательной среды и в каком количестве способствуют повышению продуктивности, был проведен ряд экспериментов по подбору оптимального состава жидкой питательной среды. Результаты оценивали по изменению продуцирующей способности штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D. Исследуемые компоненты добавляли в среду перед стерилизацией. Таким образом, было выявлено влияние различных источников углерода, органического и неорганического азота и макроэлементов на продуктивность штамма.

В результате были получены экспериментальные данные, на основании которых была разработана ферментационная среда следующего состава (г/л): Кукурузный декстрин - 60, кукурузный экстракт - 20, глюкоза - 35, сухие активированные дрожжи - 1, дрожжевой экстракт - 5, соевое масло - 1, гороховая мука - 15, СаСO₃ - 1, CuSO₄ - 0.01. СаСl₂ - 1, FeSO₄ - 0.025, солевой раствор - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), НР-20 -20, пеногаситель -1.5, вода дистиллированная до 1 л (рН=7.0±0.1), которая способствовала повышению выхода такролимуса до (1000±25) мг/л.

Получение штаммов с высоким уровнем биосинтеза антибиотических веществ зачастую сопровождается изменением требований не только к условиям культивирования, но и к составу питательных веществ и соотношению концентраций тех или иных компонентов индивидуально для каждого штамма.

Так, было установлено, что максимальный положительный эффект на биосинтез такролимуса при использовании ранее созданного состава среды для культивирования был выявлен в случае совместного использования дополнительных источников углерода и органического азота, в качестве которых использовались мальтодекстрин и соевый пептон соответственно. Было оценено влияние различных концентраций, дополнительно добавляемых в среду мальтодекстрина и соевого пептона на биосинтез целевого соединения штаммом Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D. Максимальная продуктивность штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ас-2797D была достигнута при дробной подаче мальтодекстрина в количестве 10 г/л среды в сутки. Подпитку мальтодекстрином осуществляли с 48 по 168 час (120 часов) культивирования.

В период от 72 часов до 144 часов (72 часа) роста также дробно подавали 30% раствор соевого пептона из расчета 3 г/л среды в сутки. Максимальная концентрация такролимуса в культуральной жидкости на данном этапе оптимизации составила (1100±25) мг/л.

Следующим этапом работы по повышению продуктивности штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ас-2766 D является оптимизация условий его культивирования. Основными параметрами условий культивирования штаммов являются температура процесса, рН среды, концентрация растворенного кислорода. Авторы проверили влияние этих параметров на биосинтез такролимуса с целью выбора оптимальных значений этих параметров.

А. Для проверки влиянии рН на биосинтез целевого продукта и определения его оптимальных значений проведен ряд ферментаций при различных рН среды. Поддержание заданных уровней рН производили в автоматическом режиме. Наилучшие показатели ферментации были достигнуты при рН равном 7.0-7.5.

Б. Одним из важных факторов, влияющих на продуктивность биосинтеза биологически активных веществ, в том числе и такролимуса, является содержание растворенного кислорода в ферментационной среде. В связи с этим были проведены эксперименты по оценке влияния различных концентраций растворенного кислорода на рост биомассы и продуктивности штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D в условиях автоматического контроля значения рН равном 7.0-7.5. Содержание растворенного кислорода в среде изменяли путем изменения числа оборотов перемешивающего устройства и изменения количества расходуемого в процессе ферментации воздуха. Наибольшая продуктивность по такролимусу и максимальный прирост биомассы были отмечены при концентрации растворенного кислорода 30%.

Оптимизация условий культивирования штамма Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D привела к увеличению его продуктивности до (1200±100) мг/л с одновременным снижением количества побочных продуктов.

Согласно настоящему изобретению предлагается следующий способ выделения и очистки препарата полученного в результате биосинтеза.

Как правило, выделение такролимуса из культуральной жидкости представляет собой многостадийный процесс, заключающийся в подкислении культуральной жидкости, фильтрации с отделением мицелия, последующей экстракции такролимуса из мицелия органическими растворителями, такими как спирты, хлорсодержащие углеводороды, сложные эфиры. В дальнейшем целевой продукт может быть осажден из экстракта n-гексаном с последующим растворением осадка в хлороформе и подвергнут выпариванию при пониженном давлении. Полученный технический продукт может быть очищен путем нескольких последовательных перекристаллизаций или с помощью колоночной хроматографии.

Детальное изучение примесей, появляющихся в процессе биосинтеза такролимуса штаммом Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D позволило выбрать совокупность приемов, обеспечивающих получение целевого продукта фармацевтического качества.

Эмпирическим путем были подобранны сорбенты DIAION™ НР20, НР21 и LPS 500, которые добавляют прямо в культуральную жидкость во время биосинтеза и которые не только положительно влияют на ход процесса биосинтеза, но и позволяют очень избирательно сорбировать такролимус из культуральной жидкости. Сорбенты способны понижать уровень рН, что позволяет сократить одну из операций при обработке культуральной жидкости. Сорбенты также способствуют практически полному устранению сопутствующих целевому продукту примесей -минорных компонентов, пигментов, продуктов белкового характера, солей и др., которые остаются в культуральной жидкости.

Неожиданный эффект при отделении примесей был получен при использовании в качестве сорбентов для очистки субстанции такролимуса диатомовой земли и окиси алюминия (достигалось очень значительное уменьшение трудноудаляемых примесей).

Диатомит, называемый также диатомовой землей, инфузорной землей, кизельгуром, является наиболее широко применяемым вспомогательным веществом. Он используется, в частности, для разделения различных суспензий в химической промышленности, а также в фармацевтике.

Окись алюминия имеет существенное достоинство, она может быть приготовлена в форме как катионообменного, так и анионообменного адсорбента, например, анионита в ОН-форме с диаметром зерна 0.25-0.5 мм. Микропористость и гидрофильность вещества позволяют достичь эффективной очистки.

Предлагаемая технология очистки субстанции такролимус включает в себя следующие этапы:

- Отделение гидрофобного сорбента (НР-20 и др.) от культуральной жидкости методом фильтрации с последующей отмывкой от остатков культуральной жидкости;

- Экстракция субстанции такролимус из сорбента органическим растворителем;

- Последовательная фильтрация через слой диатомовой земли и окиси алюминия;

- Очистка субстанции такролимус методом колоночной хроматографии.

По завершении ферментации сорбент отделяют от культуральной жидкости, тщательно отмывают водой и экстрагируют антибиотик этилацетатом. Экстракт, содержащий такролимус, последовательно фильтруют вначале через слой диатомовой земли, а затем через слой окиси алюминия (в анионной форме), концентрируют фильтрат в вакууме досуха, а затем чистят колоночной хроматографией, (используя колонку с сульфокатионитом, обработанную раствором серебра) для уменьшения до допустимых значений количества стереоизомеров. Упаривают полученный элюат досуха. В результате получают продукт фармацевтического качества с выходом 40% и содержанием основного вещества не менее 99,0%.

Совокупность примененных приемов позволила:

- получать субстанцию препарата такролимус фармацевтического качества;

- уменьшить количество стадий по выделению и очистке целевого продукта;

- исключить многочисленные стадии перекристаллизации субстанции с применением большого ассортимента органических растворителей (метанол, гексан, ацетонитрил);

- уменьшить объем используемых органических растворителей.

Предложенный способ позволяет существенно упростить выделение и очистку целевого продукта (существующие способы, описанные в литературе, предполагают проведение как минимум 12 операций по выделению и очистке антибиотика, а предлагаемый способ только 7).

Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении высокопродуктивного штамма способного в специально разработанных для него условиях синтезировать такролимус в промышленных масштабах с высоким выходом, составляющим 1100-1300 мг/л и способе выделения и очистки препарата, позволяющем получать субстанцию фармацевтического качества, отвечающую требованиям нормативных документов, имеющую срок годности не менее 2-х лет.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1

Биосинтез такролимуса в ферментере объемом 15 литров.

Подготовка посевного материала.

Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава, (г/л): агар-агар - 22, соевая мука - 1, дрожжевой экстракт - 5, глицерин - 20, карбонат кальция - 1, солевой раствор*(*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.) - 100 мкл, растворимый крахмал - 10.0, MgSO₄ - 1.0, K₂НРO₄ - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 7.0±0.1 до стерилизации.

Агаризованную среду засевают мицелием исходной посевной культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 5 до 7 суток, при температуре 28±0.1°С. Культура на чашках должна давать сплошной газон, поверхность складчатая, мицелий розового цвета.

Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию на вегетативной среде, состава, (г/л): глюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), вода дистиллированная до 1 л, рН 7.0±0.1 до стерилизации.

Мицелием культуры Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D, после инкубации в течение 5-7 суток при 28°С засевают питательную вегетативную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,5 л), и выращивают при 28°С в течение 36-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 230-250 об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопировании наблюдается базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована, встречаются округлые ровные колонии.

Биосинтез такролимуса.

Ферментационную среду состава, (г/л): глюкоза - 35; кукурузный декстрин - 60; гороховая мука - 15; сухие активные дрожжи - 1; дрожжевой экстракт - 5; соевое масло - 1; СаСО₃ - 1; СаСl₂ - 1; FeSO₄ - 0.025; CuSO₄ - 0.01; кукурузный экстракт - 20; смола HP 20 - 20; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворяют в 2 л горячей дистиллированной воды в ферментере и доводят объем до 8 литров.

В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа.

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы и стерилизуют отдельно в автоклаве при 118°С в течение 20 минут.

После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 26-28°С, стерильно вносят 50% раствор глюкозы. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера, температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 26±1°С. В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве - 5 л/мин (от 0 до 24 часов роста) и от 24 часов роста до конца ферментации - 8-10 л/мин. Перемешивание со скоростью 250-600 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 240-288 часов.

В качестве дополнительного источника углеводов используют мальтодекстрин, в количестве 10 г/л среды в сутки. Подпитку мальтодекстрина вносят дробно с 48 до 168 часов (120 часов) культивирования.

Начиная с 72 часов роста, ведут контроль содержания такролимуса методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении такролимуса на 240-288 часы роста процесс ферментации прекращают. К концу биосинтеза культуральная жидкость имеет значение рН 7.5±0.25. Содержание такролимуса не менее 1000-1100 мг/л (ВЭЖХ).

Пример 2

Биосинтез такролимуса в ферментере объемом 100 литров

Подготовка посевного материала.

Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава, (г/л): агар-агар - 22, соевая мука - 1, дрожжевой экстракт - 5, глицерин - 20, карбонат кальция - 1, солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворимый крахмал - 10.0, MgSO₄ - 1.0, K₂НРO₄ - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 7.0±0.1 до стерилизации.

Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной посевной культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 5 до 7 суток при температуре 28°С. Культура на чашках должна давать сплошной газон, поверхность складчатая, мицелий светло-розового цвета.

Выращивание посевного материала 1 генерации.

Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию на вегетативной среде, (г/л): глюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), вода дистиллированная до 1 л, рН 7.0±0.1 до стерилизации.

Мицелием культуры Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D, после инкубации в течение 5-7 суток при 28°С на агаризованной среде засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,5 л), и выращивают при 28°С в течение 36-48 часов на термостатируемой качалочной установке при (230-250) об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована. Посторонняя микрофлора в посевном материале должна отсутствовать.

Выращивание посевного материала 2 генерации.

В ферментер заливают 2 л дистиллированной воды и при перемешивании загружают навески всех компонентов (г/л): гдюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.).

Доводят объем среды дистиллированной водой до 8 литров.

В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа.

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы, и стерилизуют отдельно в автоклаве при 118°С в течение 20 минут.

После охлаждения в ферментер стерильно вносят простерилизованный 50% р-р глюкозы. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 28±0.1°С.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 5 л/мин. Перемешивание со скоростью 250 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 12-24 часов.

Биосинтез такролимуса.

Ферментационную среду состава, (г/л): глюкоза - 35; кукурузный декстрин - 60; гороховая мука - 15; сухие активные дрожжи - 1; дрожжевой экстракт - 5; соевое масло - 1; СаСО₃ - 1; СаСl₂ - 1; FeSO₄ - 0.025; CuSO₄ - 0.01; кукурузный экстракт - 20; смола HP 21 - 20; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворяют в 10 л горячей дистиллированнной воды в ферментере и доводят объем до 60 литров. В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа.

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы и стерилизуют отдельно в автоклаве при 118°С в течение 20 минут.

После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 26-28°С. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 26±1°С.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 35-70 л/мин. Перемешивание со скоростью 60-250 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 240-288 часов.

В качестве дополнительного источника углеводов используют мальтодекстрин, в количестве 10 г/л среды в сутки. Подпитку мальтодекстрина вносят дробно с 48 до 168 часов (120 часов) культивирования.

Начиная с 72 часов роста ведут контроль содержания такролимуса методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении такролимуса на 10-12 сутки процесс ферментации прекращают.

К концу биосинтеза часа культуральная жидкость имеет следующие показатели:

рН достигает значения (7.5±0.25);

Содержание такролимуса не менее 1100-1200 мг в 1 л культуральной жидкости (ВЭЖХ).

Пример 3

Биосинтез такролимуса в ферментере объемом 1000 литров

Подготовка посевного материала.

Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава, (г/л): агар-агар - 22, соевая мука - 1, дрожжевой экстракт - 5, глицерин - 20, карбонат кальция - 1, солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворимый крахмал - 10.0, MgSO₄ - 1.0, K₂НРO₄ - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 7.0±0.1. до стерилизации.

Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной посевной культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 5 до 7 суток при температуре 28°С. Культура на чашках должна давать сплошной газон, поверхность складчатая, мицелий светло-розового цвета.

Выращивание посевного материала 1 генерации.

Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию на вегетативной среде, (г/л): глюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), вода дистиллированная до 1 л, рН 7.0±0.1 до стерилизации.

Мицелием культуры Streptomyces tsukubensis ВКМ Ac-2797D, после инкубации в течение 5-7 суток при 28°С на агаризованной среде засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,5 л), и выращивают при 28°С в течение 36-48 часов на термостатируемой качалочной установке при (230-250) об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована. Посторонняя микрофлора в посевном материале должна отсутствовать.

Выращивание посевного материала 2 генерации.

В ферментер заливают 2 л дистиллированной воды и при перемешивании загружают навески всех компонентов (г/л): глюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.).

Доводят объем среды дистиллированной водой до 8 литров. В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа.

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы, и стерилизуют отдельно в автоклаве при 118°С в течение 20 минут.

После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 26-28°С. После охлаждения в ферментер стерильно вносят простерилизованный 50% р-р глюкозы. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 28±0.1°С.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 5 л/мин. Перемешивание со скоростью 250 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 12-24 часов.

Выращивание посевного материала 3 генерации.

В ферментер заливают 20 л дистиллированной воды и при перемешивании загружают навески всех компонентов (г/л): глюкоза - 5; крахмал растворимый - 10; глицерин - 10; дрожжевой экстракт - 5; кукурузный экстракт - 5; соевая мука полножировая - 5; СаСO₃ - 2; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.).

Доводят объем среды дистиллированной водой до 60 литров.

В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы, и стерилизуют отдельно в автоклаве при 118°С в течение 20 минут.

После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 26-28°С. После охлаждения в ферментер стерильно вносят простерилизованный 50% р-р глюкозы. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 28±0.1°С.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 35-70 л/мин. Перемешивание со скоростью 60-250 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 12-24 часов.

Биосинтез такролимуса.

Ферментационную среду состава, (г/л): глюкоза - 35; кукурузный декстрин - 60; гороховая мука - 15; сухие активные дрожжи - 1; дрожжевой экстракт - 5; соевое масло - 1; СаСО₃ - 1; СаСl₂ - 1; FeSO₄ - 0.025; CuSO₄ - 0.01; кукурузный экстракт - 20; смола LPS 500 - 20; солевой раствор* - 100 мкл (*Солевой раствор (г/л): FeSO₄ - 0.24; МnСl₂⋅4Н₂O - 0.42; СuСl₂⋅2Н₂O - 0.02; ZnSO₄ - 0.84.), растворяют в 100 л горячей очищенной воды в ферментере и доводят объем до 600 литров.

В питательной среде создают рН (7.0±0.1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа. После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 26-28°С.

В отдельной емкости готовят 50% раствор глюкозы и стерилизуют при 118°С в течение 40 минут. Далее стерильно задают 50% глюкозы в ферментер. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7.0±0.1).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 26±1°С.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 350-700 л/мин. Перемешивание со скоростью 120-280 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30%. Время ферментации 240-288 часов.

В качестве дополнительного источника углеводов используют мальтодекстрин, в количестве 15 г/л среды в сутки. Подпитку мальтодекстрина вносят дробно с 48 до 168 часов (120 часов) культивирования. В период от 72 часов до 144 часов (72 часа) роста дробно подается 30% р-р соевого пептона из расчета 3 г/л среды в сутки в качестве азотной подпитки.

Начиная с 72 часов роста, ведут контроль содержания такролимуса методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении такролимуса на 10-12 сутки процесс ферментации прекращают.

К концу биосинтеза культуральная жидкость имеет следующие показатели:

рН достигает значения (7.5±0.25);

содержание такролимуса не менее 1200-1300 мг в 1 л культуральной жидкости (ВЭЖХ).

Пример 4

Выделение такролимуса из культуральной жидкости

Культуральную жидкость (700 л), содержащую сорбент НР-20 с целевым продуктом (концентрация 1200 мг/л) порционно фильтруют на нутч-фильтре емкостью 100 л с металлическим ситом, имеющим диаметр пор 0,1 мм.

Сорбент НР-20, на фильтре дважды промывают 20 л воды и переносят сорбент в 100-литровый реактор с мешалкой для последующей экстракции этилацетатом. Для этой цели добавляют 45 л этил ацетата и перемешивают суспензию в течение 2 часов при комнатной температуре. По окончании выдержки смолу НР-20 отфильтровывают на нутч-фильтре и повторяют операцию экстракции. Объединяют экстракты и последовательно фильтруют их через слой диатомовой земли, а затем через слой окиси алюминия находящийся на нутч-фильтре. Очищенный фильтрат упаривают в вакууме досуха. Получают целевой продукт с содержанием основного вещества 96-97% с содержанием родственных примесей выше нормативного.

Отделение родственных примесей.

Очистку от родственных примесей осуществляют методом колоночной хроматографии с носителем, модифицированным ионами серебра.

Хроматографическую колонну объемом 10 л с соотношением длина/диаметр, равным 5/1, заполняют сульфокатионитом Пюролайт (Purolite) С-150 в Н-форме и пропускают через нее 1 М водный раствор нитрата серебра, заполняют ацетоном или спиртом, а затем уравновешивают, пропуская через слой адсорбента 10 л ацетона со средней скоростью 500 мл/мин. Технический такролимус растворяют в 1 л ацетона и загружают в колонну с Пюролайт (Purolite) С-150 - Ag. Элюирование проводят 25 л ацетона. Полученный элюат упаривают в вакууме досуха и получают целевой продукт с содержанием основного вещества 99.1% в пересчете на сухое вещество. По качественным показателям субстанция такролимуса отвечает требованиям нормативных документов и хранится в течение 2 лет без существенных изменений качества.

Пример 5

Процесс осуществляется аналогично примеру 4. В качестве сорбента используется смола LPS 500, концентрация такролимуса в культуральной жидкости не менее 1200 мг/л. В результате получают целевой продукт с содержанием основного вещества 99.3% в пересчете на сухое вещество, отвечающий требованиям нормативных документов.