ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS N.V. EP 317/402-X "БАЛАНС-НАРИНЭ", ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОГАСТРИТНОГО И ПРОТИВОЯЗВЕННОГО КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой штамм лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus, который может быть использован для получения кисломолочных лечебно-диетических продуктов.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая.

Препараты и продукты, содержащие в своем составе лактобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.

Предшествующий уровень техники
За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе штаммов лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus (патент США 3639666; патент Франции 2622452; патент Швейцарии 637297; патент ФРГ 2421066; патент Японии 05227946; Международная заявка (WO) 93/09793).

Однако штаммы лактобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные штаммы имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.

Известен штамм ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus-13 (Арагац), депонированный под номером 9606 в музее культур Института микробиологии НАН Армении (Заявка на патент РФ 94017944, МПК С 12 N 1/20, опубл. 27.03.96 г. ). Штамм устойчив к антибиотикам, антисептическим и химиотерапевтическим тест-препаратам. Штамм был получен методом химического мутагенного воздействия, то есть путем внесения в среду культивирования летальных для штамма доз химических препаратов и дальнейшего размножения единичных выживших от экстремального воздействия лактобактерий.

Однако отсроченная биологическая безвредность полученного таким образом ацидофильного штамма и продуктов на его основе детально не изучена, хотя у него отсутствует острая токсичность при апробации в клинических условиях.

Известен штамм Lactobacillus acidophilus N.V. EP 317/402 "НАРИНЭ" ААА, используемый при приготовлении препаратов, диетических и лечебно-профилактических продуктов для лечения дисбактериоза и его последствий (Патент РФ 2146454, МПК А 23 С 9/12, опубл. 20.03.2000 г.). Штамм получен в результате отбора из исходной культуры Lactobacillus acidophilus N. V. EP 317/402 "НАРИНЭ" селекцией по антагонистической активности в отношении кишечной микрофлоры, устойчивости к антибиотикам широкого спектра действия.

Однако, несмотря на направленную селекцию указанного штамма по антагонистической активности в отношении кишечной микрофлоры, он не подавляет жизнедеятельность в желудочно-кишечном тракте таких патогенных бактерий, как Helicobacter pylori, которые вызывают разрушение слизистой оболочки кишечника и желудка и приводят к различным формам гастрита и язвенным болезням желудка и двенадцатиперстной кишки.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм Lactobacillus acidophilus N. V. EP 317/402 "НАРИНЭ" (А. с. СССР 163573, МПК С 12 N 1/20, опубл. 27.04.1964 г.). Исходная культура выделена из фекалий новорожденного здорового ребенка. Штамм идентифицирован и получен Л.А. Ерзинкяном в институте микробиологии АН Армении. Среды культивирования: молоко цельное или обезжиренное стерилизованное, молочная сыворотка стерилизованная. Температура культивирования +37-39^oС. Факультативный анаэроб. Время образования сгустка - 3-7 час в зависимости от температуры инкубации и количества внесенной закваски (1-3%) в молоко. Частота пересева культуры - 1 раз в месяц. Количество клеток бактерий штамма в 1 мл закваски "Наринэ" насчитывается в пределах 150-250 млн. Штамм входит в группу ацидофильных бактерий, являющихся микроаэрофилами. Минимальная температура роста свыше 20^oС, оптимальная 35-39^oС, летальная 68-70^oС. Максимум кислотообразования в молоке 300-360^oТ. Данный штамм продуцирует значительное количество полезных для человека, особенно для детского организма, антимикробных веществ (Ерзинкян Л.А. Биологические особенности некоторых расc лактобактерий. Изд-е Академии наук Арм. ССР, Ереван, 1971, - с. 172).

Однако штамм-прототип обладает недостаточной антагонистической активностью, в частности не подавляет жизнедеятельность в желудочно-кишечном тракте таких патогенных бактерий, как Helicobacter pylori, которые вызывают разрушение слизистой оболочки кишечника и желудка и приводят к различным формам гастрита и язвенным болезням желудка и двенадцатиперстной кишки.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus, обладающий более широким спектром антагонистической активности, в частности в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двенадцатиперсной кишки и значительно большим содержанием полезных веществ, необходимых для коррекции дисбактериозов и различных желудочно-кишечных заболеваний.

Указанные результат достигается получением штамма Lactobacillus acidophilus N. V. Ep 317/402-X (авторское наименование "Баланс-Наринэ") путем селекции исходной культуры Lactobacillus acidophilus N.V.Ep 317/402 "Наринэ" и направленного отбора по следующим показателям:
- антагонистическая активность по отношению к микроорганизмам, вызывающим желудочно-кишечные заболевания, в частности, патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двенадцатиперсной кишки;
- способность продуцировать полезные вещества (витамины, аминокислоты, антиоксиданты);
- устойчивость мембранных структур бактериальных клеток к внешним факторам (кислотность, температура и т.п.), обеспечивающая сохранение высокого титра лактобактерий в процессе хранения.

Заявляемый штамм Lactobacillus acidophilus N.V.Ep 317/402-X "Баланс-Наринэ" депонирован под МЦКМ В-17 в Коллекции Межрегионального центра коррекции микроценоза человека (г. Новосибирск).

Штамм Lactobacillus acidophilus N.V.Ep 317/402-X "Баланс-Наринэ" имеет следующие свойства.

Культурально-морфологические:
Неподвижные аспорогенные палочки 2-20 х 0,8-0,9 мкм, клетки расположены одиночно или в виде коротких цепочек, неподвижны, грамположительные, спор и капсул не образуют.

По Граму окрашиваются положительно. При окрашивании метиленовой синью в клетках наблюдаются четко выраженные метахроматические зерна.

Гомоферментативные, микроаэрофилы. Колонии на элективных агаризованных питательных средах глубинные, мелкие, чаще образуют клубки в виде перепутанных нитей.

Физиологические:
Минимальная температура роста 20^oС, оптимальная +37-39^oС.

Предлагаемый штамм имеет повышенную протеолитическую, ароматообразующую, антагонистическую активность, синтезирует в молоке витамины, аминокислоты.

Клетки бактерии не образуют индола и скатола, желатину не разжижают, энергично сбраживают лактозу. Штамм непатогенен и нетоксичен. Температурный диапазон роста штамма 20-48^oС. Физиологический диапазон рН жизнедеятельности бактерий штамма 3,8-6,5. Каталазоотрицательный. Разлагает глюкозу без образования газа. Логарифмическая фаза роста в сыворотке или молочной среде (обезжиренном молоке) заканчивается к 8-14 часам с образованием равномерного сгустка. Сбраживает: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, дульцит, галактозу. Не сбраживает - маннит, глицерин. Индол не образует.

Штамм продуцирует значительное количество безвредных антибиотических веществ, подавляющих рост и развитие как грамм-положительных (St aureus), так и грамм-отрицательных (Е. соli) патогенных бактерий, в том числе всех без исключения бактерий-возбудителей дизентерии и дезинтериоподобных заболеваний.

Штамм высокочувствителен к антибиотикам: бензилпенницилину, стрептомицину, эритромицину, карбипицилину, линкомицину, цифобиду, левомицитину, доксициклину, фуразолидону.

Штамм слабочувствителен к антибиотикам: гентамицину, тетрациклину, олететрину, кефзолу, рифампицину, ампицилину, канамицину, нитроксалину, фузидину, клофорану, полимиксину, ампиоксу.

Нечувствителен к антибиотикам: сульфодиметоксину, сульфадимезину, бисептолу, торавиду, сульфалену.

Антагонистическая активность штамма, выраженная в миллиметрах зон угнетения роста патогенных тест-штаммов Флекснера и штамма Зонне, протея, энтеропатогенной кишечной палочки, золотистого стафилококка, составляет не менее 15 мм.

В цельном молоке с содержанием СОМО 8-10% динамика роста и кислотообразования выглядит следующим образом.

Среда культивирования: молоко коровье цельное, нормализованное или обезжиренное (обрат).

Температура культивирования: 37-39^oС.

Время инкубации: 5-7 ч, в зависимости от температуры инкубации количество закваски, вносимой в молоко, 1,5-2%.

Поддержание штамма.

Методы хранения:
- на жидкой питательной среде при +5-7^oС;
- лиофилизированная культура при +5-7^oС;
- в жидком азоте при минус 193^oС.

Среды хранения:
- молоко цельное стерилизованное;
- молоко обезжиренное стерилизованное;
- молочная сыворотка стерилизованная.

Частота пересевов 1 раз в 2 месяца.

Штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" может быть использован в бактериальных заквасках, а также для приготовления лечебно-диетических продуктов.

Селекция предлагаемого штамма проведена путем традиционного пассирования первоначального штамма 317/402 на молочно-сывороточной среде без внесения каких-либо искусственных химических веществ-мутагенов, а потому штамм не обладает потенциальной опасностью.

Пример 1. Методика отбора клеток штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" на антагонистическую активность по отношению к патогенным бактериям Helicobacter pylori.

Прилипание бактерий Helicobacter pylori к стенкам желудочно-кишечного тракта моделировалось на известной их способности прикрепляться к клеткам раковых клеток (аденокарциномы) кишечника, например к монослою клеток НТ29. Для этого клетки НТ29 культивируют на обезжиренных стеклах при 37^oС в минимальной модифицированной среде Дульбекко (ДМЕМ), содержащей 10% галактозы и диализованную телячью плазму в атмосфере 10% CO₂ и 90% воздуха и используют до 2-го деления.

Бактерии Helicobacter pylori культивируют отдельно на пластинах Мюллера-Хиттона на 10%-ной овечьей крови в течение 72 часов при 37^oС в атмосфере 5% О₂, 10% СО₂ и 85% азота. С пластинок соскребают и собирают бактерии и промывают в физрастворе. Клетки Helicobacter pylori наносят на монослой клеток НТ29 в количестве 10⁶ кл/см² и подвергают инкубации в течение 2 часов при 37^oС с последующим отмыванием неприкрепившихся клеток. Количество клеток Helicobacter pylori, прикрепившихся к клеткам НТ29, определяют тестом на уреазу. Интенсивность реакции считывают со спектрофотометра на длине волны 550 нм.

В суспензию клеток исследуемого штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus N. V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" помещают пластинки с монослоями бактерий Helicobacter pylori, прилипших к клеткам НТ29, и инкубируют в течение 1 часа с последующим промыванием пластинок с монослоями и тестированием на уреазу. Суспензия клеток на основе заявляемого штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ" способна (после длительного селекционного отбора) снизить содержание прикрепленных клеток Helicobacter pylori к монослою клеток НТ29 с 10⁶ кл/см² до 10² кл/см².

Это подтверждает, что заявляемый штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ" и продукты его метаболизма обладают антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих гастрит или язву желудка, и, таким образом, обладает противогастритным и противоязвенным свойством.

Пример 2. В результате селекции штамма авторами были отобраны вариации пассируемого штамма, самопроизвольно изменившиеся в процессе культивирования (на 110-115 пассаже), по признаку увеличения суммарной плотности липопротеиновых структур мембран клеток штамма 317/402. Устойчивость мембранных структур повышает жизнеспособность клеток штамма при максимальном закислении питательной среды (до 300 - 350 град.Т), т.е. при неблагоприятных для штамма окружающих условиях. Повышенная стабильность мембранных структур увеличивает конкурентноспособность штамма также при симбиотическом культивировании с другими молочнокислыми бактериями - продуцентами кислот и при прохождении клетками штамма кислого желудочного "барьера" в случае его перорального применения.

Особенно это важно для лиофилизированных форм бактерий.

В таблице 1 приведена динамика роста штаммов Lactobacillus acidophilus N₁V₁ Ep 317/402 (прототип) и 317/402-Х "Баланс-Наринэ" (заявляемый штамм) в молочной ростовой среде при температуре +40^oС.

Анализ таблицы 1 показывает, что заявляемый штамм по сравнению с прототипом наиболее полно использует ростовые ресурсы относительно бедной ростовой среды (обезжиренное молоко без ростовых факторов), имеет более высокие ростовые и технологические характеристики по сравнению со штаммом-прототипом, а именно: сокращено время сквашивания на 4 часа, повысился на порядок титр в готовом продукте, а по истечении 96 часов культивирования биологическая активность заявляемого штамма выше на один порядок. Кроме того, заявляемый штамм по сравнению с прототипом имеет высокую активность кислотообразования, что способствует накоплению летучих кислот в концентрате лактобактерий, и, следовательно, повышенную антагонистическую активность продуктов, полученных с использованием данного штамма.

Пример. 3. Исследование аминокислотного состава биомассы, приготовленной на основе штамма L. acidophilus 317/402-Х "Баланс-Наринэ".

Исследования аминокислотного состава биомассы, приготовленной на основе штамма L. acidophilus 317/402-Х "Баланс-Наринэ", проводились на аминокислотном анализаторе "Biotronik" производства США.

Условия эксперимента
1. Подготовка пробы: осаждение общего белка сульфосалициловой кислотой; удаление белков центрифугированием.

2. Определение содержания свободных аминокислот в пробе выполнялось на аминокислотном анализаторе "Вiotronik LC 5001" при следующих параметрах:
- Колонка 3.2х385 мм "Biotronik resin 2710";
- Подвижная фаза: последовательность из пяти цитратных буферных растворов различной кислотности и ионной силы;
- Скорость потока: буфер - 0.3 мл/мин, реагент - 0.55 мл/мин;
- Объем пробы: 50 мкл;
- Количественное определение с использованием калибровочного раствора аминокислот "Hamilton" (USA);
- Детектирование: постколоночное окрашивание раствором нингидрина в ДМСО, L_vis - 570 нм.

Результаты анализа аминокислотного состава биомассы бактерий L. acidophilus 317/402-Х "Баланс-Наринэ" приведены в таблице 2.

В биомассе бактерий на основе L. acidophilus 317/402-Х "Баланс-Наринэ" повышено содержание свободных аминокислот и достигает порядка 14.7 %, из которых доля незаменимых аминокислот достигает 50.01%.

Из таблицы 2 видно, что повышенное количество незаменимых аминокислот из общей суммы свободных аминокислот, особенно таких, как валин - 8.3%, лейцин -13.4%, лизин - 7.7%, а также метионин - 3.1%, аминокислот с "разветвленной цепью" имеет важное физиологическое значение, поскольку эти аминокислоты наиболее активно участвуют в процессах синтеза белка. Так, недостаток валина приводит к расстройству координации движений, недостаток лейцина вызывает изменения в почках и щитовидной железе, недостаток лизина приводит к нарушению процессов кровообразования. В жидком концентрате бифидобактерий содержание аргинина повышено до 7.7 %. Повышенное содержание аргинина биологически важно, поскольку свободный аргинин способствует стимуляции иммунной системы организма, кроме того, он обладает антиоксидантными свойствами, что благоприятно сказывается на увеличении срока хранения жидкого концентрата бифидобактерий.

Несмотря на повышенную утилизацию штаммом L. acidophilus 317/402-Х "Баланс-Наринэ" свободных аминокислот во время роста бактерий в молочной ростовой среде, обогащенной ростовыми факторами, в конечном продукте остается достаточно большое количество свободных аминокислот - 418,39 мг/л, особенно незаменимых. Кроме того, набор свободных аминокислот физиологичен, что подтверждается отношением концентраций аминокислот метионина/изолейцина, равным коэффициенту 0,83, достаточно близкому к коэффициенту 1 (оптимальное физиологическое соотношение).

Пример 4. Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ".

Антагонистическая активность штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов (таблица 3).

Антагонистическая активность штамма L. acidophilus N.V. Ep 317/402-X "Баланс-Наринэ" и его колонизационная активность наиболее полно были изучены in vivo на организменно-популяционной модели - лабораторных мышах в хроническом эксперименте.

- Исследования были проведены на племенных мышах обоего пола колонии ICR в течение 3 лет на 18 поколении рандомбринга в количестве 900 самок и 450 самцов.

- Препарат лактобактерий производился на основе штамма L. acidophilus N. V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" на молочной среде с добавлением ростовых факторов.

- Препарат лактобактерий применялся в дозе 0,1 мл на голову в сутки в течение 1 месяца ежедневно.

- Бактериологические исследования фекалий мышей проводилось в соответствии с методическими указаниями "Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики".

- Проводилось наблюдение за выживаемостью, весом мышей.

- На основании данных о числе желтых тел и мест имплантации живых и мертвых эмбрионов определяли пост- и преимплантационную смертность зародышей.

Результаты бактериологического исследования молодняка 1 поколения, полученного от родителей, получавших жидкий препарат лактобактерий, показали, что произошло не только значительное снижение уровня патогенной и условно-патогенной микрофлоры, но и увеличение бифидо- и лактобактерий почти в равной степени с 10⁵ до 10⁸-10⁹ микробных тел в 1 г фекалий (табл.4).

Бактериологические исследования фекалий племенного молодняка следующих поколений показали наличие сформировавшегося барьерного эффекта гастро-инстестинальной микрофлоры по отношению к таким патогенным микроорганизмам, как Salmonella, Staphylococcus aurеus, Clostridium digficile, грибы Candida, Proteus и др. Это является результатом колонизирующей способности кишечника мышей штаммом L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ". Более раннее становление микрофлоры новорожденных мышат через коррекцию микрофлоры родителей обеспечило хорошую защищенность организма и возможность противостоять инфекции извне.

Пример 5. Получение лечебно-диетического противогастритного противоязвенного кисломолочного продукта на основе закваски лактобактерий L. аcidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ".

Закваска лактобактерий, приготовленная на основе нового штамма L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ", была использована для приготовления кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания. В качестве основы используют молоко, которое нормализуют по массовой доле жира. Затем молоко подвергают "глубокой" пастеризации при температуре 92±2^oC с выдержкой не менее 15 мин и охлаждают до температуры заквашивания 35^oС. Сквашивают молоко в резервуарах для кисломолочных напитков с охлаждаемой рубашкой, снабженных специальными мешалками для равномерного перемешивания молочного сгустка. В молоко вносят производственную закваску на основе жидкой закваски лактобактерий (штамм L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ") в количестве 2-5% от массы нормализованной смеси. Полученную смесь сквашивают при температуре 38±1^oС в течение 4-5 ч. Окончание сквашивания определяют по образованию достаточно прочного сгустка и кислотности, которая должна быть не более 100^oТ. По окончании сквашивания продукт охлаждают до температуры 25-30^oС, подавая в межстенное пространство резервуара ледяную воду. Затем сгусток перемешивают 10-15 мин. Перемешанный сгусток сразу же подают на розлив, а затем доохлаждают до температуры 6±2^oС в холодильной камере в упакованном виде. Срок годности кисломолочного продукта, упакованного в тару с герметичной укупоркой, - 5 суток.

Экспериментальные исследования на животных, профилактика и лечение больных людей в условиях стационара и амбулаторно показывают, что кисломолочный продукт, изготовленный на основе заявляемого штамма, обладает высокой антагонистической активностью, противогастритными и противоязвенными свойствами и повышенным сроком сохранности при высоком титре, что позволяет использовать его как препарат для лечения гастритов и язв желудочно-кишечного тракта, иммунокоррекции организма; лечить дисбактериозы бактериального и вирусного происхождения, диспепсию и дизентерию без применения антибиотиков.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что для патентования предлагается новый отселектированный штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus N. V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ", обладающий устойчивым проявлением выше перечисленных свойств при последующем пассировании музейной культуры штамма на печеночной среде Блаурокка. Всего заявляемый штамм прошел 57 пассажей без изменения отселектированных свойств.

Предлагаемый штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" по сравнению со штаммом-прототипом имеет следующие преимущества:
- увеличена биосинтетическая активность штамма и его ростовая активность по утилизации свободных аминокислот молочных питательных сред, которая возросла в 9-13 раз в отношении большинства свободных аминокислот;
- сохранность живых лактобактерий в молочной среде культивирования увеличилась на один порядок;
штамм обладает более высокими лечебно-профилактическими свойствами, в частности обладает целенаправленными противогастритными и противоязвенными свойствами.