СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ ИЗ АСЦИДИИ

Изобретение относится к области получения биологически активных веществ из морских гидробионтов, которые могут быть использованы в качестве биологически активной добавки к пище, в ветеринарии и косметике.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ получения из асцидии биологически активного вещества «Хаурантин» (ТУ 9169-007-20783642-96), обладающего стресс-протективной активностью, включающий разделку асцидии, промывку туники, измельчение ее, сушку, экстрагирование 40% этиловым спиртом в соотношении 1:1 путем перколяции и получение спиртового экстракта. В химический состав хаурантина входят свободные аминокислоты, липиды, простагландины, каротиноиды, витамин С (табл.1).

Недостатком данного изобретения является низкое содержание каротиноидов за счет неполного использования сырья из асцидии, а также использования 40% этилового спирта в качестве экстрагента. При указанных выше условиях извлечения активных компонентов из туники асцидии в раствор преимущественно переходят свободные аминокислоты, жирные кислоты, фосфолипиды и минеральные вещества. Целевое извлечение каротиноидов при этом не может быть обеспечено из-за низкой концентрации растворителя и в связи с частичным разрушением их при повышенной температуре. Соответственно этому содержание каротиноидов в продукте, полученном по способу-прототипу, составляет 0,002 мг/мл, что соответствует менее чем 1% от их количества в исходном сырье.

Кроме того, наличие в конечном продукте этилового спирта значительно сужает потенциальную возможность его применения, связанную с токсическим действием на печень и другие органы человека, также возрастными ограничениями, при этом присутствие этилового спирта в конечном продукте может требовать специального лицензирования производства.

Задачей, решаемой изобретением, является получение биологически активной добавки из асцидии на основе масла с повышенным содержанием каротиноидов, обладающей антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью.

Поставленная задача достигается тем, что асцидию разделывают, полученное сырье промывают, измельчают, сушат, экстрагируют полярным органическим растворителем и расфасовывают, при этом согласно изобретению в качестве сырья используют сырую или высушенную мантию или тунику или мантию и тунику из асцидии при соотношении мантии и туники 1:2, причем сырье сушат при 40°С до влажности 7-10%, экстрагирование проводят 96% этанолом или ацетоном в соотношении сырье:экстрагент 1:1-1:5 в течение 16-24 часов, полученный экстракт фильтруют, соединяют с маслом и водой в соотношении 5:1:10 для сырого сырья и 2:1:4 для сухого сырья соответственно, в темноте в течение 22-24 часов проводят реэкстракцию, отделяют масляный экстракт, промывают его водой, а затем готовый продукт сушат.

Новым в предлагаемом изобретении является:

- в качестве сырья используют сухую мантию и сырую тунику и/или мантию асцидии;

- экстрагирование проводят 96% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, составляющем 1:1-1:5;

- экстракт соединяют с маслом и водой в соотношении 5:1:10 для сырого сырья и 2:1:4 для сухого сырья соответственно, реэкстрагируют в темноте в течение 22-24 часов.

Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критериям изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники.

Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «Промышленно применимо», так как по данной технологии, в настоящее время, получено санитарно-эпидемиологическое разрешение Роспотребнадзора №77.99.13.003.Т.002367-10.07 на производство масляного экстракта асцидии как БАД к пище, а также выпущена ее опытная партия.

Сущность метода заключается в следующем: асцидию, свежевыловленную или замороженную (после предварительной разморозки), разделывают: тунику и мантию отделяют от внутренностей и подошвы, промывают водой. Полученное сырье перед измельчением либо сушат при 40°С до влажности 7-10%, как в прототипе, либо оставляют сырым. Использование в качестве сырья мантии позволяет более полно использовать исходное сырье, что увеличивает выход конечного продукта из асцидии. Использование в качестве сырья сырой туники или мантии или одновременно туники и мантии снижает затраты на производство конечного продукта. Тунику или мантию или тунику и мантию (в соотношении 2:1), сырую или сухую, экстрагируют полярным органическим растворителем - 96% этиловым спиртом или ацетоном. Применение 96% этилового спирта необходимо для извлечения из сырья более неполярных компонентов биологически активных веществ, в частности каротиноидов. Соотношение сырье - экстрагент составляет 1:5 для сырого сырья и 1:1-1:3 для сухого сырья. Соотношение сырье - экстрагент определяется количеством воды в экстрагируемой ткани. При концентрации органического растворителя менее 70-75% эффективность экстракции каротиноидов резко падает.Опытным путем было установлено, что соотношение сырье - экстрагент 1:5 оптимально для сырого сырья, а 1:2 для сухого (возможен интервал 1:1-1:3). Экстракцию проводят в стеклянных или металлических емкостях в течение 16-24 часов. Полученный экстракт фильтруют через газовую ткань или центрифугируют, помещают в делительную воронку, добавляют к нему растительное масло (соевое, подсолнечное, кукурузное или рапсовое) и воду в соотношении 5:1:10 для сырого сырья и 2:1:4 для сухого сырья соответственно. Соотношение экстракт (спирт или ацетон):масло:вода подобрано экспериментально и тем самым обеспечивает полноту реэкстракции и высокую концентрацию каротиноидов в масле. Реэкстракцию проводят в темном месте в течение 22-24 часов. Введение стадии реэкстракции позволяет использовать для экстракции сырья также ацетон с тем же соотношением сырье - экстрагент, что и для этанола. После ее прохождения водно-спиртовую или водно-ацетоновую фазу сливают, а масляный экстракт промывают водой при интенсивном механическом перемешивании или встряхивании до удаления следов этанола или ацетона, а затем сушат.

Полученный масляный экстракт не содержит спирта или следов ацетона, кроме того, возможно придание ему более привлекательного торгового вида путем фасовки его в капсулы.

Масляный экстракт, полученный предлагаемым способом, представляет собой темно-красную жидкость, содержащую сложную смесь каротиноидов в количестве 120-400 мкг/мл, т.е. в 600-2000 больше чем в прототипе, включая астаксантин, галоцинтиаксантин, фукоксантинол и др. Согласно исследованиям, проведенным в НИИ эпидемиологии и иммунологии СО РАМН г.Владивосток, масляный экстракт из асцидии обладает иммуностимулирующим действием, определенным по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов, а также относительно высокой антиоксидантной активностью, стимулируя антиокислительные свойства сыворотки крови и ингибируя образование малонового диальдегида, конечного продукта перекисного окисления. Отчет об испытаниях прилагаем.

Масляный экстракт из асцидии не токсичен для мышей в дозе 33 мл/кг.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

Асцидию, свежевыловленную или размороженную, разделывают, тунику и мантию отделяют от внутренностей и подошвы, промывают водой и измельчают на фарш-волчке. 1 кг сырья в соотношении туника-мантия 2:1 (это среднее соотношение этих органов в 1 экземпляре асцидии) помещают в стеклянную емкость, заливают 5 л 96%-ного этилового спирта и экстрагируют в течение 24 часов. Полученный экстракт фильтруют через газовую ткань. Экстракт (5 л) помещают в 20-литровую делительную воронку, добавляют 1 л соевого масла и 10 л воды. Реэкстракцию проводят в темном месте в течение 22 часов. После ее прохождения масляный экстракт сливают, промывают водой при постоянном помешивании или встряхивании для удаления следов этанола. Конечный продукт - масляный экстракт сушат.

Выход конечного продукта составляет 0,95 л на 1 кг сырого сырья. При концентрации каротиноидов в сырье 23 мг/100 г сырой ткани и выходе каротиноидов 60% концентрация их в масляном экстракте составляет 140 мкг/мл.

Фагоцитарная активность нейтрофилов мышей (иммуностимулирующая активность) полученного препарата составляла по фагоцитарному показателю - 83% и по фагоцитарному числу - 2.6 при дозе 50 мкл/мышь. Общая антиоксидантная активность, определенная по накоплению в модельной системе желточных липопротеидов конечных продуктов перекисного окисления (МДА), составляла 32% при той же дозе. Полученные результаты были достоверно выше, чем в контрольных образцах.

Пример 2

Тунику асцидии (10 кг) сушат (лиофильно, при атмосферном давлении при 40°С) до содержания влаги 10%, измельчают в дробилке до частиц 3 мм. Измельченное сырье (3 кг) помещают в стеклянную емкость, заливают 6 л ацетона и экстрагируют 16 ч. Экстракт фильтруют (6 л), помещают в 25-литровую делительную воронку, добавляют 3 л подсолнечного масла и 12 л воды. Реэкстракцию проводят в течение 24 часов в темноте. Масляный экстракт отделяют, промывают водой при интенсивном встряхивании (не менее трех раз) до отсутствия запаха ацетона в масляном экстракте, сушат, а затем капсулируют.

Выход конечного продукта составляет 0,28 л на 1 кг сырого сырья. При концентрации каротиноидов в сыром сырье 25 мг/100 г ткани и выходе каротиноидов 50% концентрация их в масляном экстракте составляет 400 мкг/мл.

Фагоцитарная активность нейтрофилов мышей полученного препарата составляла по фагоцитарному показателю - 87% и по фагоцитарному числу - 2.9 при дозе 50 мкл/мышь. Общая антиоксидантная активность, определенная по накоплению в модельной системе желточных липопротеидов конечных продуктов перекисного окисления (МДА), составляла 36% при той же дозе. Полученные результаты были достоверно выше, чем в контрольных образцах.

Пример 3

В качестве сырья используют сырую мантию асцидии. Экстракцию сырья проводят ацетоном, дальнейший процесс получения конечного продукта осуществляют аналогично примеру 1.

Выход конечного продукта составляет 0,95 л на 1 кг сырого сырья, выход каротиноидов 60%. При концентрации каротиноидов в сырье 20 мг/100 г сырой ткани туники концентрация их в масляном экстракте составляет 120 мкг/мл.

Фагоцитарная активность нейтрофилов мышей полученного препарата составляла по фагоцитарному показателю - 81% и по фагоцитарному числу - 2.6 при дозе 50 мкл/мышь. Общая антиоксидантная активность, определенная по накоплению в модельной системе желточных липопротеидов конечных продуктов перекисного окисления (МДА), составляла 32% при той же дозе. Полученные результаты были достоверно выше, чем в контрольных образцах.

Пример 4

Аналогичен примеру 2, однако в качестве сырья используют мантию асцидии. Высушенную мантию асцидии экстрагируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 22 часов.

Выход конечного продукта составляет 0,28 л на 1 кг сырого сырья, выход каротиноидов 50%. При концентрации каротиноидов в сырье 20 мг/100 г сырой ткани концентрация их в масляном экстракте составляет 320 мкг/мл.

Фагоцитарная активность нейтрофилов мышей полученного препарата составляла по фагоцитарному показателю - 82% и по фагоцитарному числу - 2.7 при дозе 50 мкл/мышь. Общая антиоксидантная активность, определенная по накоплению в модельной системе желточных липопротеидов конечных продуктов перекисного окисления (МДА), составляла 31% при той же дозе. Полученные результаты были достоверно выше, чем в контрольных образцах.

Пример 5

В качестве сырья используют сырую тунику асцидии. Экстракцию сырья проводят ацетоном, дальнейший процесс получения конечного продукта осуществляют аналогично примеру 1. Выход конечного продукта составляет 0,95 л на 1 кг сырого сырья, выход каротиноидов 60%. При концентрации каротиноидов в сырье 25 мг/100 г сырой ткани туники концентрация их в масляном экстракте составляет 160 мкг/мл.

Фагоцитарная активность нейтрофилов мышей полученного препарата составляла по фагоцитарному показателю - 85% и по фагоцитарному числу - 2.8 при дозе 50 мкл/мышь. Общая антиоксидантная активность, определенная по накоплению в модельной системе желточных липопротеидов конечных продуктов перекисного окисления (МДА), составляла 37% при той же дозе. Полученные результаты были достоверно выше, чем в контрольных образцах.