СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения пропионилхолинэстеразы (ПХЭ) - фермента, который может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и корбаматных соединений.

Известен способ получения псевдохолинэстеразы из плазмы крови лошадей, при этом разделение белковых фракций плазмы проводят высаливанием сернокислым аммонием, а выделение псевдохолинэстеразы производят фракционированием солями тяжелых металлов совместно с сернокислым аммонием (А.С. №187238 Способ получения псевдохолинэстеразы).

Недостатком данного способа является его многоступенчатость и трудоемкость процесса получения конечного продукта за счет использования при его получении солей тяжелых металлов. Кроме того, использование в качестве сырья плазмы крови лошадей не позволяет получить конечный продукт с высокой активностью.

Известен способ получения холинэстеразы из ганглиев головоногих моллюсков (Михеев Е.В. Автореферат, Комплексная технология биологически активной добавки к пище «Тинростим» и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров, Владивосток, 2009). В описанном способе сублимированные ганглии кальмаров обрабатывают ферментными препаратами протеолитического действия, гомогенат центрифугируют, полученную массу очищают методом ультрафильтрации. Удельная активность полученного препарата составляет 24,7 Е/мг белка.

Недостатком данного способа является применение ферментных препаратов протеолитического действия, а также использование ультрафильтрации для очистки конечного продукта, которые значительно снижают активность холинэстеразы.

Наиболее близким аналогом по технической сущности к заявляемому техническому решению является «Способ получения холинэстеразы» (А.С. №543652 от 15.03.1974 г.) ,который заключается в гомогенизации сырья, обработке его органическими растворителями, фильтровании смеси, центрифугировании, пропускании надосадочной жидкости через хроматографическую колонку. В качестве сырья использовали ткань электрического органа ската.

Недостатком данного способа является использование в качестве сырья электрического органа ската, что не позволяет наладить промышленный масштаб производства конечного продукта, так как количество сырья очень ограничено. Кроме того, использование в качестве растворителей как органических, так и неорганических веществ, что значительно снижает выход готовой продукции. Полученный данным способом продукт является химически чистый и его можно использовать только в лабораторных условиях в научных целях.

Задачей данного изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани, включающий гомогенизацию ткани, фильтрование смеси, центрифугирование, пропускание надосадочной жидкости через хроматографическую колонку и сушку, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ в качестве исходного сырья используют ганглии головоногих моллюсков, гомогенизированное сырье подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц., полученный гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 (сырье : вода), при этом в хроматографической колонке в качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза), а перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. При этом раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.

Замороженное сырье нервной ткани головоногих моллюсков (ганглии) гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработка ультразвуком позволяет добиться более тонкого измельчения сырья, в результате чего большее количество фермента переходит в раствор. Гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода и периодически перемешивают в течение 1-2 ч и температуре 3-5°C. Затем фильтруют через капроновый фильтр или центрифугируют на центрифуге (3500 об/мин) для отделения надосадочной жидкости, которая является источником пропилхолинэстеразы. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 2-4 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивают натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносят количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Несорбированные белковые компоненты смывают с колонки фосфатным буфером. Контроль наличия в элюате белков контролируют по величине поглощения длины волны при 280 нм.

Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl.

Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости фермента перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка. Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.

Заявляемое техническое решение соответствует критериям изобретения:

«новизна», так как для получения пропионилхолинэстеразы впервые использованы приемы обработки гомогенизированного сырья ультразвуком, а для получения ПХЭ с более высокой удельной активностью использована колонная хроматография с Con-А-сефарозой и 0,5% раствор полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000;

«промышленная применимость» - данная технология проста в исполнении и может быть применена для получения ПХЭ в промышленных масштабах.

Пример конкретного выполнения.

1 кг замороженных ганглий командорского кальмара гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработанный ультразвуком гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода. Гомогенат периодически перемешивают в течение 1-2 ч при температуре 3-5°C и фильтруют через капроновый фильтр для отделения надосадочной жидкости. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до конечной концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 3 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивали натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносили количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Не сорбированные белковые компоненты смывали с колонки фосфатным буфером.

Контроль наличия в элюате белков контролировали по величине поглощения длины волны при 280 нм. Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl. Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости ПХЭ перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка.

Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат в количестве 300 мг из 1 кг сырья) с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.