Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к области пищевой и медицинской промышленности, в частности к способу получения иммуностимулятора из морских животных и гидробионтов, и может применяться как биологически активная добавка к пище (перорально) и как лечебное инъекционное средство для людей и животных.
Известен способ получения иммуностимулятора из гидробионтов, например моллюска дрейссены (Патент РФ №2374891 от 16.07.2008, МПК А23J 1/04). При этом иммуностимулятор получают путем ферментолиза. Сырье измельчают вместе со створками и подвергают гидролизу ферментным препаратом, взятым в количестве 0,1-0,2% к массе фаршевой смеси, процесс ведут в течение 360-480 мин, при рН среды 3-11 и температуре 54-56°С, далее фермент инактивируют путем нагрева массы до 70-75°С в течение 10 мин, упаривают и фильтруют с отделением гидролизата от осадка, в качестве ферментного препарата используют ферменты растительного, животного или микробиального происхождения.
Известен способ получения иммуностимулятора из морских гидробионтов (патент РФ №2468593 от 29.09.2011, МПК А23L 1/33). При этом в качестве сырья используют мидии, которые измельчают, сушат и смешивают с ферментным препаратом. В качестве ферментного препарата используют препарат "Протозим" с активностью не менее 490 ПЕ/г протеолитического действия. Проводят гидролиз. В смесь добавляют воду, при этом сырье, ферментный препарат и воду берут в соотношении 20:1:400. Полученный гомогенат нагревают в течение 30-40 мин до температуры 50°С и выдерживают при данной температуре и постоянном перемешивании в течение 10 ч. Отделяют жидкую фракцию и концентрируют ее до содержания влаги не более 20%. При этом получают продукт, обладающий высоким содержанием низкомолекулярных пептидов.
Известен способ получения иммуностимулятора из кукумарии (Патент РФ №2147239, МКИ 7 А61К 35/56 "Общеукрепляющее неспецифическое иммуномодулирующее средство»). Измельченную мышечную ткань кукумарии смешивают с водой, добавляют протеолитический фермент, поваренную соль и 0,1% бензойнокислого натрия, смесь нагревают и термостатируют, затем фермент инактивируют нагреванием, фильтруют и консервируют 96%-ным этиловым спиртом или спиртовой вытяжкой из внутренностей кукумарии.
Недостатком вышеуказанных аналогов является то, что в качестве сырья использовали мышечную ткань или гидробионы целиком, в которых, как известно, содержание пептидов не превышает 1%, а биологическая активность обусловлена присутствием в ткани тритерпеновых гликозидов или других компонентов. К недостаткам относится также длительность и многостадийность процесса получения, низкий уровень иммуностимулирующей активности.
Имунностимулятор, полученный из нервной ткани морских гидробионтов, рыб и морских млекопитающих, содержит комплекс низкомолекулярных пептидов и аминокислот, обладающих иммностимулирующей активностью, стимуляцией мозгового крообращения, повышенной стойкостью к инфекционным заболеваниям.
Известен способ получения иммуностимулятора из нервной ткани морских гидробионтов, обладающих иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2091072 от 10.03.1993, МПК А61К 35/50). В данном способе ганглии кальмара или каракатицы гомогенизируют в воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 3,5-4,5 0,1% хлористого цинка. Смесь выдерживают 28-48 ч. После отделения надосадочной жидкости ее подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный фильтрат концентрируют в 5,5 раз методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000-5000 Д и подвергают очистке в трехкратном объеме подщелоченной до рН 9,0-10,0 воды. Очищенный концентрат снова концентрируют в 2 раза на том же пористом материале и подвергают стерилизующей фильтрации. Затем проводят стерильный розлив препарата и лиофильно высушивают.
Известен способ получения биологически активного вещества, обладающего иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2105504 от 05.06.1996, МПК А61К 35/50). Иммуностимулятор получен из нервной ткани кальмара или каракатицы. Ганглии (нервную ткань) промывают водой и ацетоном, затем помещают в ацетон и выдерживают в ацетоне при температуре 4-10°С, гомогенизируют в воде, подкисляют до рН 3,5-4,5 0,1%-ным раствором хлористого цинка, выдерживают 24-48 ч, отделяют надосадочную жидкость, которую обрабатывают ацетоном при соотношении надосадочной жидкости и ацетона 1:6 по объему, при температуре 3-5°С, отделяют осадок, высушивают его, растворяют в воде с рН 6,0-7,0 и фильтруют.
Наиболее близким по достигаемому результату является способ получения биологически активного вещества, обладающего иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2222337 от 03.07. 2002, МПК А61К 35/50). При этом иммуностимулятор получают из нервной ткани головоногих моллюсков: кальмаров, каракатиц, осьминогов; мозг морских млекопитающих: белух, кашалотов, китов, моржей, ларги, нерпы, лахтака, акибы; мозг рыб: лососевых, осетровых, сельдевых, тресковых, камбаловых, окуневыхи т.п. Сырье размораживают, измельчают, экстрагируют 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и выделяют целевой продукт путем ультрафильтрации и диафильтрации, которые проводят в две стадии на двух мембранах с различным пределом разделения по молекулярной массе. Иммуностимулятор, полученный по предлагаемому способу, имеет четко ограниченные пределы молекулярной массы 1000 -10000-15000 Да. Концентрированный раствор с целевым веществом молекулярной массой 1000-10000 Да стерильно фильтруют на мембранах с размером пор 0,22 мкм, разливают в стерильных условиях во флаконы с последующей лиофильной сушкой.
Недостатками перечисленных способов является:
- использование уксусной кислоты;
- использование хлористого цинка;
- использование ацетона;
- отделение осадка и процесс ультрафильтрации;
- длительность процесса;
- низкий выход конечного продукта (менее 1%).
Задача, решаемая изобретением, - упрощение способа получения иммуностимулятора из нервной ткани морских гидробионтов и млекопитающих и повышение выхода конечного продукта за счет использования экзогенных протеолитических ферментов.
Поставленная задача решается следующим образом.
Способ получения иммуностимулятора, включающий размораживание сырья, измельчение его, получение надосадочной жидкости, отделение ее и высушивание конечного продукта, при этом измельченное сырье ферментируют при гидромодуле 1:1-5, рН 5.5-7,5, температуре 22-45°С, в течение 1,5-3,5 ч под действием протеолитических ферментов в количестве 15-45 ед. активности на 1 г сырья, а надосадочную жидкость отделяют путем фильтрации.
В качестве сырья используют нервную ткань головоногих моллюсков: кальмаров, каракатиц, осьминогов; мозг морских млекопитающих: белух, кашалотов, китов, моржей, ларги, нерпы, лахтака, акибы; мозг рыб: лососевых, осетровых, тресковых, сельдевых, камбаловых, окуневых и т.п.).
В качестве протеолитических ферментов используют протеолитические ферменты (например, протамекс, коллагеназу, мегатерии, трипсин, химотрипсин, пилорин), а конечный продукт либо сублимируют, либо сушат на вакуум-сушильном аппарате барабанного типа. При этом выход конечного продукта составляет 5-10% от массы исходного сырья.
Новым в заявляемом техническом решении является то, что иммуностимулятор получают путем ферментирования сырья (нервной ткани морских гидробионтов и млекопитающих) протеолитическими ферментами, при этом сохраняется биологическая активность конечного продукта, а выход от массы исходного сырья составляет 5-10% в зависимости от вида сырья, в то время как в прототипе он менее 1%.
Использование ферментов протеолитического действия способствует образованию дополнительного количества низкомолекулярных пептидов, оказывающих стимулирующее действие.
Повышение выхода конечного продукта за счет использования протеолитических ферментов определено экспериментальным путем. Достигаемый результат иллюстрируется данными.
|
Биологическую активность заявляемого иммуностимулятора определяли путем исследования фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови
Гепаринизированную венозную кровь помещали в термостат на 20-30 мин для оседания эритроцитов. С помощью пипетки отбирали верхнюю (светлую) фракцию, содержащую лейкомассу, трижды отмывали 0,85% NaCl (по 10 мин при 1000 об/мин). Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса, доводили до концентрации 2×106/мл по нейтрофилам и исследовали их фагоцитарную активность.
Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по отношению к латексу. Вначале нейтрофилы крови здоровых доноров инкубировали с исследуемыми БАВ в течение 60 минут при 37°С в конечной концентрации - 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,01 мкг/мл. Затем взвесь клеток в объеме 100 мкл соединяли в центрифужных пробирках со 100 мкл латекса (размер частиц латекса 1,5-2 мкм) в соотношении 1:20 и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем пробирки центрифугировали при 1000 об/мин 5 минут и сливали надосадочную жидкость. Из осадка готовили мазки, фиксировали метанолом, окрашивали азур-II-эозином и микроскопировали, определяя фагоцитарный показатель (ФП %) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом.
|
По ФП - Статистически значимые различия с контролем - Тинростим 0,01 мкг/мл и Заявляемый иммуностимулятор (ЗИ) 0,01 мкг/мл; мкг - микрограмм; 1 мг - 1000 мкг
|
По ФЧ - Статистически значимые различия с контролем - Тинростим 0,01 мг/кг и 0,01 мкг/мл; Заявляемый иммуностимулятор (ЗИ) - 0,01 мкг/мл и 0,01 мкг/мл.
Результаты, представленные в таблице 2 и 3, свидетельствуют, что достоверных различий в иммуностимулирующей активности препаратов тинростим и заявляемого иммуностимулятора нет. Таким образом, активность препарата, полученного методом ферментативного гидролиза, совпадает с активностью препарата, полученного по способу прототипа.
Пример 1
10 кг замороженных ганглий кальмара размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:2, рН 7,5. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента протамекс из расчета 25 ед. на 1 г сырья. Доводят температуру до 25°С и ферментируют в течение 1,5 ч. После окончания процесса ферментолиза смесь фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Жидкую фракцию направляют на сублимационную сушку. Выход конечного продукта составляет 1 кг, что равняется 10% от веса исходного сырья.
Полученный конечный продукт представляет собой порошок светлосерого цвета, хорошо растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях и содержит 45% свободных аминокислот и 35% пептидов с молекулярной массой менее 15 кДа.
|
|
Выход тинростима из 10 кг сырья приведен в таблице 1.
Пример 2
10 кг мороженой нервной ткани мозга морских млекопитающих размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:5. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента коллагеназы из расчета 15 ед. на 1 г сырья. Доводят температуру до 45°С и ферментируют в течение 3,5 ч при рН 5.5. После окончания процесса ферментолиза смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Сушку жидкой фракции проводят на вакуум-сушильном аппарате барабанного типа. Выход конечного продукта составляет 0,5 кг, что равняется 5% от веса исходного сырья.
Пример 3
10 кг мороженой нервной ткани мозга рыб размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:3. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента трипсин из расчета 45 ед. на 1 г сырья. Смесь ферментируют в течение 2,5 ч при температуре 22°С и рН 7.5. После окончания процесса ферментолиза смесь фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Жидкую фракцию лиофилизируют. Выход конечного продукта составляет 0,7 кг, что равняется 7% от веса исходного сырья.