Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS BULGARICUS CNCM 1-1968, ЛИШЕННЫЙ β-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ, ЗАКВАСКА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ШТАММ, КИСЛОМОЛОЧНЫЙ ПРОДУКТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым вариантам bulgaricus и их использованию для получения кисло-молочных продуктов.

Йогурты обычно получают путем ферментации молока с помощью ассоциации Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus. В процессе ферментации, которую осуществляют при температуре около 40-45°С, эти бактерии используют главным образом лактозу в качестве энергетического субстрата и продуцируют молочную кислоту, которая вызывает коагуляцию молока; когда рН достигает значения примерно 4,8-4,5, то на этой стадии ферментацию (также называемую "скисанием") заканчивают путем охлаждения продукта. Этот продукт затем выдерживают на холоде в продолжение процесса приготовления и расфасовки и вплоть до его потребления.

Однако охлаждение полностью не останавливает молочно-кислого брожения; даже когда продукт поддерживают при температуре 4°С, наблюдают постепенное повышение его кислотности с течением времени.

Это явление, известное под названием вторичного скисания, является ответственным за ухудшение органолептических свойств продукта во время его хранения.

Вторичное списание происходит по существу вследствие использования бактериями, и главным образом L. bulgaricus, лактозы, остающейся в продукте по окончании контролируемой стадии скисания. Во избежание этого было предложено использовать штаммы L. bulgaricus, не вызывающие ферментации лактозы или вызывающие ее в очень незначительной степени.

Одним из существенных ферментов для ферментации лактозы является β-галактозидаза, которая гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы. Так, для получения не вызывающих вторичного скисания штаммов L. bulgaricus было предложено получать искусственные мутанты или селекционировать природные мутанты с измененной активностью этого фермента.

Например, в Европейском патенте 402450 на имя GENENCOR описывается получение путем локализованного мутагенеза гена β-галактозидазы условных мутантов L.bulgaricus, у которых β-галактозидаза, которая активна во время ферментации при температуре 40°С, теряет свою активность при температуре или рН, соответствующих условиям хранения кисло-молочных продуктов.

В заявке на патент Японии 90053437 описывается получение искусственного мутанта L. bulgaricus, полностью утратившего способность ферментировать лактозу, и селекция природного мутанта с пониженной способностью вызывать ферментацию лактозы; эти мутанты, как один, так и другой, тем не менее способны развиваться и нормальным образом подкислять фазу в присутствии S. thermophilus при условии, что среда дополнена глюкозой. Субкультуры этих мутантов сохраняют свои свойства вызывать скисание в случае молока, лишенного глюкозы, после 10 пересевов.

В Европейском патенте 0518096, на имя для производства йогурта предлагается использовать вызывающие в очень незначительной степени вторичное скисание мутанты Lactobacillus bulgaricus, предварительно селекционированные по критерию делеции фрагмента гена β-галактозидазы. Скрининг и охарактеризовывание этих мутантов облегчены, так как наличие этой делеции может быть легко проверено по профилям рестрикции. Кроме того, известно, что делеции являются необратимыми мутациями, что позволяет легко получать стабильные мутантные штаммы из основного штамма. В Европейском патенте 0518096 описываются 2 типа селекционированных таким образом, вызывающих в очень незначительной степени вторичное скисание мутантов. Первые имеют делецию, затрагивающую только ген β-галактозидазы; когда они ассоциированы с S. thermophilus и культивированы в молоке, они обладают, даже в отсутствие добавки глюкозы, способностью к росту и способностью вызывать скисание, сравнимыми с таковыми дикого штамма, от которого они происходят. Вторые имеют более значительную делецию, распространяющуюся по крайней мере на 1 т.п.н ниже гена β-галактозидазы; когда они ассоциированы с S. thermophilus, они растут более медленно и вызывают скисание намного меньше, чем дикий штамм, от которого они происходят; добавка глюкозы к культуральной среде оказывает только незначительное влияние на их свойства в отношении скисания и вторичного скисания.

Природные мутанты, у которых β-галактозидаза неактивна, намного более трудно селекционировать и сохранять в виде чистых культур в случае точечных мутаций, чем в случае делеционных мутантов; это объясняется более незначительной вероятностью того, что точечная мутация дает неактивный протеин, гораздо большей трудностью локализации и охарактеризовывания точечных мутаций по профилям рестрикции и очень значительной степенью реверсии.

Заявитель в настоящее время нашел другие природные мутанты L. bulgaricus, не имеющие делении в гене, кодирующем β-галактозидазу, и обладающие полезными технологическими характеристиками. В рамках настоящего изобретения нонсенс-мутант, неспособный ассимилировать лактозу, был выделен из культуры L. bulgaricus дикого типа. Ассоциированный с S. thermophilus, при культивировании в молоке, он растет и окисляет более медленно, чем дикий штамм, от которого он происходит. Однако его рост и его способность вызывать скисание являются квазинормальными, когда молоко дополнено глюкозой.

Предметом настоящего изобретения является мутантный штамм L. bulgaricus, лишенный β-галактозидазной активности, отличающийся тем, что он имеет мутацию, вводящую нонсенс-кодон в одну из последовательностей, кодирующих лактозный оперон, и, в особенности, в последовательность, кодирующую β-галактозидазу.

Штамм L. bulgaricus согласно изобретению депонирован, согласно Будапештскому соглашению, 14 января 1998 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM), хранящейся в Институте Пастера, 25, rue du Docteur Roux, в Париже, под номером I-1968.

Этот штамм имеет следующие морфологические и биохимические характеристики:

морфология: грамположительный микроорганизм; тонкие, плеоморфные, аспорогенные, изолированные или в виде короткоцепочечных, неподвижные палочки;

метаболизм: гомоферментативный; (-)-каталаза;

ферментация сахаров: (+)-D-глюкоза, (+)-D-фруктоза, (+)-D-манноза, (+)-эскулин.

Изобретатели секвенировали лактозный оперон у мутанта I-1968. Соответствующая последовательность представлена в прилагаемом перечне последовательностей под номером 1. Последовательности продуктов трансляции (пермеаза и β-галактозидаза) соответственно представлены под номерами 2 и 3.

Анализ этой последовательности показал наличие двух точечных мутаций: одна, на уровне гена пермеазы (положение 122 в последовательности №1), приводит к замене аминокислоты (Lys→Asn); другая, на уровне гена β-галактозидазы (положение 4519 в последовательности №1), вводит стоп-кодон.

Хотя сохраняются активные сайты этой последовательности (положения 464 и 531), продуцируемая этим мутантом β-галактозидаза является неактивной. Кроме того, изобретатели установили, что эта мутация остается стабильной после нескольких серий пересевов в культуральную среду, содержащую глюкозу. Однако в культуральной среде в отсутствие глюкозы эта нонсенс-мутация очень быстро ревертирует в степени примерно 10^-6.

Настоящее изобретение также относится к мутантным штаммам, неспособным ассимилировать лактозу и происходящим от штамма I-1968. Такие штаммы могут быть получены, например, за счет индукции направленным мутагенезом других мутаций в лактозном опероне штамма I-1968.

Предметом настоящего изобретения также является молочный фермент, в частности йогуртовый фермент, отличающийся тем, что он включает по крайней мере один штамм L. bulgaricus согласно изобретению, такой, как указанный выше, предпочтительно ассоциированный по крайней мере с одним штаммом S. thermophilus.

Для получения фермента согласно изобретению можно использовать любой штамм S. thermophilus, пригодный для производства йогурта; выбор одного или нескольких штаммов S. thermophilus может быть осуществлен в зависимости от дополнительных характеристик, которые, в случае необходимости, желают придать конечному продукту.

В качестве примера штаммов S. thermophilus, которые могут быть использованы в ассоциации со штаммом L. bulgaricus согласно изобретению, можно назвать следующие штаммы, депонированные в Национальной коллекции культур микроорганизмов, хранящейся в Институте Пастера, 25, rue du Docteur Roux, в Париже:

- штамм, депонированный 25 августа 1994 г. под номером I-1470, и штамм, депонированный 23 августа 1995 г. под номером I-1620; эти два штамма описаны в заявке на Европейский патент, опубликованной под номером 96/06924;

- штаммы, депонированные 30 декабря 1994 г. под номерами I-1520 и I-1521; эти два штамма описаны в Международной заявке РСТ 96/20607;

- штамм, депонированный 24 октября 1995 г. под номером 1-1630; характеристики этого штамма описаны в Международной заявке РСТ 96/01701.

Эти штаммы могут быть ассоциированы между собой или с одним или несколькими другими промышленными штаммами S. thermophilus.

Штамм или штаммы S. thermophilus ассоциированы со штаммом или штаммами L. bulgaricus согласно изобретению таким же образом и в тех же пропорциях, что и в случае традиционных йогуртовых ферментов; популяция бактерий L. bulgaricus согласно изобретению может составлять, например, 10-90%, предпочтительно 20-50%, по отношению к общей бактериальной популяции.

Предметом изобретения также является способ получения кисло-молочного продукта, отличающийся тем, что он включает стадию, в ходе которой молоко ферментируют с помощью фермента, содержащего по крайней мере один штамм L. bulgaricus согласно изобретению, в присутствии по крайней мере одного сахара, ассимилируемого вышеуказанным штаммом; таким сахаром может быть, в частности, фруктоза, манноза и предпочтительно глюкоза. Предпочтительно вышеуказанным кисло-молочным продуктом является йогурт.

Способ согласно изобретению подобен традиционным способам получения йогурта в том, что касается основных условий осуществления контролируемой стадии скисания; в частности, это скисание осуществляют при температуре 20-45°С и предпочтительно 30-45°С и в "одну партию", то есть в одну стадию и при использовании одного ферментационного чана.

Продолжительность этой контролируемой стадии скисания составляет обычно порядка 6-24 часов и предпочтительно порядка 6-16 часов; следовательно, она более длительная, чем в случае классических способов получения йогурта (где она длится в течение 3-5 часов при температуре 44°С). В самом деле, штаммы L. bulgaricus согласно изобретению, даже ассоциированные с S. thermophilus, растут и вызывают скисание намного более медленно, чем дикие штаммы.

Кроме того, скорость роста и скисания в случае штаммов L. bulgaricus согласно изобретению очень сильно варьирует в зависимости от добавленного к молоку количества глюкозы. Это свойство позволяет контролировать их рост и способность вызывать скисание путем простого добавления желательного количества глюкозы в начале ферментации.

Изобретатели, кроме того, наблюдали, что во время использования штаммов L. bulgaricus или ферментов согласно изобретению скисание в значительной степени замедляется, когда рН достигает области 4,8-4,5 (которая соответствует области рН, где прекращается скисание в случае традиционного способа), и стабилизируется, даже если молоко выдерживают при температуре ферментации, при плато рН. Значение уровня этого плато рН зависит главным образом от добавленного количества глюкозы.

Это свойство позволяет уменьшать, даже ликвидировать фазу охлаждения, используемую в традиционных способах производства йогурта для прекращения ферментации. Кроме того, это свойство позволяет отказаться от необходимости измерять рН для определения оптимального момента прекращения ферментации; для определенных фермента и добавляемого количества глюкозы можно без опасности чрезмерного скисания прекращать ферментацию по истечении заданной продолжительности, рассчитанной в зависимости от времени, необходимого для достижения плато рН. Это позволяет лучше контролировать стабильность конечного рН и текстуру продукта в конце ферментации.

Для осуществления способа согласно изобретению и в зависимости от степени скисания, которой желают достичь, количество глюкозы, добавляемое к молоку до ферментации, предпочтительно составляет 0,5-10 г/л, предпочтительно 0,5-5 г/л.

Таким образом полученный ферментированный продукт может храниться в течение нескольких часов при температуре, близкой к температуре ферментации, без снижения значения рН, что позволяет ликвидировать установки для промежуточного хранения на холоде и повышать производительность ферментационных чанов.

Использование способа согласно изобретению позволяет уменьшать вторичное скисание в ферментированных продуктах в процессе их хранения в течение более продолжительного времени. Степень вторичного скисания может варьировать в зависимости от состава фермента и используемого количества глюкозы. Однако вторичное скисание всегда заметно меньше такового, наблюдаемого в случае йогуртов, получаемых с помощью традиционных ферментов и способов.

Проведенные изобретателями экспериментальные исследования, например, показали, что в одних и тех же условиях хранения (28 дней хранения при температуре 10°С) ΔрН (разница между значением рН в день 0 и значением рН в день 28) составляет 0,05-0,4 в случае продуктов, полученных с помощью фермента согласно изобретению, тогда как она всегда выше 0,7 в случае контрольных ферментов, в которых штамм L. bulgaricus согласно изобретению заменен диким штаммом.

Это незначительное вторичное скисание сопровождается высокой выживаемостью штаммов фермента; популяция L. bulgaricus в конце хранения в ферментированном продукте, полученном согласно изобретению, только незначительно меньше, чем в контрольном продукте.

Предметом настоящего изобретения также являются кисло-молочные продукты, которые могут быть получены при использовании способа согласно изобретению.

Эти продукты могут храниться в течение более длительного времени и при более высокой температуре, чем продукты, полученные традиционными способами, и обладают органолептическими свойствами, которые остаются стабильными в процессе хранения.

Пример 1

Биохимический анализ β-галактозидазной активности мутанта согласно изобретению

β-Галактозидазную активность штамма I-1968 сравнивали с β-галактозидазной активностью дикого штамма L. bulgarius (ниже называемого LbS), от которого он происходит.

Бактерии культивируют в течение ночи в среде MRS-агар (MERCK) при температуре 37°С в сосуде для анаэробиоза (MERCK) в присутствии фиксатора кислорода ( A; MERCK).

Порцию из 10 мкл (NUNC) бактерий ресуспендировали в 1 мл стерильной воды. Бактерии лизировали путем двух циклов интенсивного перемешивания в течение 20 с со скоростью 5000 об/мин в присутствии стеклянных микрошариков (диаметр 0,5 мм; BIOSPEC PRODUCTS), затем добавляли 0,15 мл хлороформа. Всю совокупность перемешивают в течение 30 мин при температуре 37°С, затем дополняют с помощью 2 мл стерильной воды при температуре 4°С. После этого измеряли β-галактозидазную активность: к 0,2 мл клеточной суспензии добавляют 1,2 мл 0,067 М буфера NaH₂PO₄; pH 6,8; 0,05 мл L-цистеина (SIGMA) с 0,05 мл О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (SIGMA). Ферментативную реакцию прекращают спустя 0, 2, 5 или 10 мин с помощью 1 мл 10%-ного буфера Nа₂СО₃ и проводят измерение оптической плотности при 400 нм супернатанта, получаемого после центрифугирования реакционной смеси.

Галактозидазные активности основного штамма LbS и мутанта I-1968 согласно изобретению, измеренные в зависимости от времени, представлены на чертеже.

Эти результаты показывают, что β-галактозидаза полностью неактивна в случае мутанта согласно изобретению.

Пример 2

Стабильность мутанта I-1968 L. bulgaricus

Стабильность мутанта I-1968 тестировали в средах, содержащих в качестве источников углерода либо смесь глюкозы и лактозы, либо одну лактозу.

Полученную в содержащей глюкозу среде MRS культуру I-1968 субкультивировали в стерилизованном молоке, к которому добавлено 2 г/л автолизата дрожжей и которое дополнено или нет 20 г/л глюкозы. Когда pH достигло значения 5,2 (коагуляция молока), из каждой субкультуры отбирают образцы, в которых анализируют способность бактерий ферментировать сахара, а также наличие β-галактозидазной активности (тест на планшете с X-gal [5-бром-4-хлориндолил-β-D-галактозидом]): белые колонии = меньше β-галактозидазы; синие колонии = больше β-галактозидазы).

Результаты представлены в табл. I.

Эти результаты показывают, что при наличии глюкозы штамм I-1968 не ревертирует в штамм, способный использовать лактозу. Однако в среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода, наблюдают быструю реверсию штамма I-1968 в исходное состояние.

Пример 3

Свойства в отношении скисания, вторичного скисания и выживаемости варианта I-1968 L. bulgaricus в симбиозе с S. thermophilus: случай способа получения стабильного йогурта (ферментация в вентилируемой камере)

Готовят ферменты для получения йогурта путем ассоциации штамма I-1968 согласно изобретению с различными промышленными штаммами S. thermophilus (используемые штаммы S. thermophilus ниже называют ST1, ST2 и ST3).

В качестве сравнения готовят ферменты путем ассоциации основного штамма LbS и тех же штаммов S. thermophilus.

Для приготовления ферментов производили посев штаммов в количестве 1% в следующий состав:

Состав на 1 л:

135 г сухого обезжиренного молока;

2 г автолизата дрожжей;

920 мл дистиллированной воды;

20 г глюкозы (только для штамма I-1968).

Гидратация: 10 мин.

Пастеризация: 30 мин при температуре 95°С.

Молоко затем охлаждали до температуры 44°С и инокулировали, потом инкубировали при температуре 44°С вплоть до достижения кислотности 85°Д (градусы Дорника) для стрептококков и 80°Д для лактобацилл.

Культуры затем объединяли для получения фермента, образованного 80% Streptococcus thermophilus и 20% Lactobacillus bulgaricus.

Таким образом полученные ферменты использовали для инокуляции следующей препаративной формы:

Состав на 1 л:

99% молока;

0,1 или 2 г/л глюкозы.

Гидратация: 10 мин.

Пастеризация: 10 мин при температуре 95°С.

Молоко затем охлаждали до температуры 44°С и инокулировали с помощью 1% фермента.

Состав фермента и добавляемое количество глюкозы для каждого эксперимента указаны в табл. II.

После инокуляции молоко распределяли по колбам и инкубировали при температуре 44°С. В течение инкубации следили за профилем скисания. Получение продуктов останавливали при рН 4,6 охлаждением в холодной камере (16 ч при температуре 4°С ).

Затем продукты подвергали тесту на хранение при температуре 10°С. Согласно этому тесту измеряют рН и кислотность по Дорнику спустя 1, 14, 21 и 28 дней хранения.

Результаты скисания (время для достижения рН 4,6 и значение рН за 24 часа) представлены в табл. III.

Результаты теста на хранение при температуре 10°С (контроль рН и кислотности по Дорнику) и выживаемость (популяции S. thermophilus и L. bulgaricus), осуществляемого в течение 28 дней, представлены в табл. IV.

Эти результаты показывают, что йогурты, полученные с помощью ассоциаций штамма I-1968 с одним или двумя штаммами S. thermophilus, обладают чрезвычайно низким вторичным скисанием по сравнению с такими же ассоциациями с основным штаммом LbS, при этом сохраняя богатую популяцию в конце ферментации и высшую выживаемость в течение 28 дней при температуре 10°С.

Прекращение скисания и сохранение рН около 4,6-4,5 по крайней мере в течение 24 ч при температуре 44°С, в рамках производства йогурта, позволяет сокращать, даже устранять обычно осуществляемую в резервуаре фазу охлаждения.