ШТАММ LACTOBACILLUS MUCOSAE ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Изобретение относится к новому штамму Lactobacillus mucosae и к его применению, в частности для облегчения дисфункции кишечного барьера.

Эпителиальный слой кишечника действует как защитный барьер, защищающий поверхность слизистой оболочки от содержимого просвета кишечника и окружающей среды.

Эпителиальный слой кишечника имеет низкий уровень проницаемости вследствие присутствия плотных контактов (TJ) между клетками. Плотные контакты являются межклеточными комплексами, которые функционируют в качестве барьера, ограничивающего перенос веществ из просвета кишечника в слизистую оболочку кишечника. Разрушение этих комплексов может быть вызвано экзогенными факторами, такими как некоторые энтеропатогены, или провоспалительными цитокинами, включая, в частности, TNF-α и IFN-γ; это ведет к повышенной эпителиальной параклеточной проницаемости, которая способствует различным кишечным нарушениям, включая, в частности, синдром раздраженного кишечника, хронические воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона или язвенный колит) и глютеновую болезнь (для обзора см. CLAYBURGH et al., Lab Invest, 84, 282-91, 2004).

Известно, что различные пробиотические молочнокислые бактерии обладают защитными свойствами на кишечном эпителии, благодаря различным механизмам (для обзора см. OHLAND & MACNAUGHTON, American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 298, G807-G19, 2010). Однако было продемонстрировано, что только некоторые штаммы нескольких видов улучшают барьерную функцию эпителия посредством снижения его проницаемости. (RESTA-LENERT&BARRETT, Gastroenterology, 130, 731-46, 2006) сообщает, что Streptococcus thermophilus и Lactobacillus acidophilus предотвратили повышение кишечной проницаемости, вызванной TNF-a и IFN-γ. (MIYAUCHI et al., JDairySci, 92, 2400-8, 2009) исследовали эффекты 4 молочнокислых бактерий (один штамм L.delbrueckii, один штамм L. casei, один штамм L. gasseri и штамм L. Rhamnosus OLL2838) на ослабленную функцию кишечного барьера и параклеточную проницаемость, вызванную TNF-a. Они выявили, что L. Rhamnosus OLL2838 значительно подавлял вызванное TNF-α повышение параклеточной проницаемости, в то время как другие тестируемые штаммы не обладают значительными эффектами. (DONATO et al., Microbiology, 156, 3288-97, 2010) продемонстрировали, что штамм LGG L. Rhamnosus уменьшал эффекты TNF-α и IFN-γ на целостность эпителиального барьера. (EUN et al., Apmis, 1 19, 49-56, 2010) показал, что штамм DN 114001 (CNCM 1-1518) L.casei также предотвращал увеличение эпителиальной проницаемости, вызванной TNF-α или IFN-γ. В публикации Z. ZAKOSTELSKA et al. описано, что лизат Lactobacillus paracasei DN-114001 (CNCM 1-1518) усиливает целостность кишечного клеточного барьера in vivo (ZAKOSTELSKA et al., 2011.PlosOne 6(11)).

В первый раз Lactobacillus mucosae выделили из тонкого кишечника свиньи, а позднее выделяли из кишечника и влагалища человека, а также из кишечника собаки, теленка и лошади.

Впервые она была охарактеризована в качестве вида ROOS и его сотрудниками (ROOS et al., Int J Syst Evol Microbiol, 50 Pt 1, 251-8, 2000). Таксономически Lactobacillus mucosae тесно связана с Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri и Lactobacillus pontis. Она содержит ген mub, кодирующий белок клеточной поверхности, который придает ей способность связываться со слизью. ROOS et al. описывали ее в качестве грамположительных, каталазанегативных, неспорогенных, неподвижных палочек, растущих при 45°C, но не при 15°C.

Было показано, что некоторые штаммы Lactobacillus mucosae обладают противомикробной активностью. TZORTIS al. (TZORTZIS et al., J Appl Microbiol, 96, 552-9, 2004) сообщает, что штамм NCIMB 41149 L. Mucosae имеет ингибирующую активность in vitro на Echerichia coli и Salmonella typhymurium, когда они вырастают в присутствии мальтоолигосахарида или мальтозы, но не в присутствии глюкозы, изомальтоолигосахаридов, гентиобиозы или целлобиозы. В публикации заявки PCT WO 2011/107960 описано применение штаммов L. Mucosae DSM 23409 и DSM 23408 для лечения или профилактики E. Coli инфекций.

До настоящего времени не сообщали о каком-либо эффекте любого штамма вида Lactobacillus mucosae на барьерную функцию кишечника.

Авторы изобретения идентифицировали новый штамм Lactobacillus mucosae, который кроме противомикробной активности обладает способностью улучшать барьерную функцию кишечника, в частности, посредством снижения проницаемости кишечного эпителия.

Предметом по настоящему изобретению является этот штамм, который был помещен в соответствии с Будапештским договором в коллекцию CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rueduDocteurRoux, Paris), 3 февраля 2011 года, под номером I-4429.

Штамм CNCM I-4429 является грамположительным, каталаза-негативным микроорганизмом, неподвижным, неспорогенным; клетки встречаются в виде палочек с размерами 1×2-4 мкм, разделенных по парам или в качестве маленьких цепочек.

Он обладает противомикробными свойствами и, в частности, сильно ингибирует рост Salmonella enterica.

Он также обладает свойством уменьшать проницаемость кишечного барьера, другими словами, свойством защиты или восстановления эпителиальной параклеточной непроницаемости, вызванной TNF-α.

Предмет настоящего изобретения также включает штаммы Lactobacillus mucosae, которые можно получать посредством мутагенеза или генетической трансформации штамма CNCM I-4429. Предпочтительно, эти штаммы сохраняют свойства штамма CNCM I-4429 уменьшать проницаемость кишечного барьера. Они могут быть штаммами, в которых один или несколько эндогенных генов штамма CNCM I-4429 мутировал(мутировали), например, чтобы модифицировать некоторые из их метаболических свойств (например, способность этого штамма метаболизировать сахара, его устойчивость к кишечному транзиту, его устойчивость к кислотности, его пост-ацидификация или его продуцирование метаболитов). Они также могут быть штаммами, полученными в результате генетической трансформации штамма CNCM I-4429 с применением одного или нескольких гена(ов), представляющего(щих) интерес, делая возможным, например, наделить дополнительными физиологическими характеристиками указанный штамм, или экспрессировать белки, представляющие терапевтический или вакцинный интерес, которые желательно ввести посредством указанного штамма.

Эти штаммы можно получать из штамма CNCM I-4429 средствами общепринятых способов для случайного или сайт-специфического мутагенеза и генетической трансформации лактобактерий, таких как описанные, например, GURY et al. (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) или VELEZ et al. (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), или методом, известным как "перетасовка генома" (PATNAIK et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; WANGY et al, J Biotechnol., 129, 510-15, 2007).

Предметом по настоящему изобретению является также способ получения штамма Lactobacillus mucosae, способного уменьшить проницаемость кишечного барьера, включающий стадию мутагенеза или генетической трансформации штамма CNCM I-4429.

Предметом по настоящему изобретению является также способ получения фракции клеток, способной уменьшить проницаемость кишечного барьера, из штамма Lactobacillus mucosae в соответствии с изобретением. Указанные клеточные фракции являются, в частности, препаратами ДНК или препаратами бактериальной стенки, полученными из культур указанного штамма. Они также могут быть супернатантами или фракциями этих супернатантов.

Предметом по настоящему изобретению являются также композиции, содержащие штаммы Lactobacillus mucosae в соответствии с изобретением или штамм Lactobacillus mucosae, который можно получать посредством мутагенеза или генетической трансформации штамма CNCM I-4429 или клеточной фракции, полученной из указанного штамма.

Эти композиции могут, в частности, быть молочными ферментами, комбинирующими штамм Lactobacillus mucosae в соответствии с изобретением с одним или несколькими другими, необязательно пробиотическим(и) штаммом(ами) молочнокислых бактерий. В качестве примера штаммов молочнокислых бактерий можно упомянуть штаммы из рода Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, и Bifidobacterium, в частности штаммы Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. reuteri, L. johnsonii, L. rhamnosus, Lactobacillus casei ssp. paracasei штаммы.

Они также могут быть пищевыми продуктами, и в частности молочными продуктами, или фармацевтическими или косметическими продуктами, содержащими штамм Lactobacillus mucosae в соответствии с изобретением, или штамм Lactobacillus mucosae, полученный посредством мутагенеза или генетической трансформации штамма CNCM I-4429 или фракции клеток, полученной из указанного штамма.

Когда указанный штамм присутствует в форме живых бактерий, они предпочтительно присутствуют в пропорции, по меньшей мере, 10⁵ КОЕ на грамм, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁶ КОЕ на грамм продукта, более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁷ КОЕ на грамм, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁸ КОЕ на грамм.

Предметом по настоящему изобретению является также способ получения композиции, как описано выше, характеризующийся тем, что он включает:

- получение Lactobacillus mucosae в соответствии с изобретением или штамм Lactobacillus mucosae, получаемый посредством способа, описанного выше, или клеточной фракции в соответствии с изобретением и

- включение указанного штамма или фракции в указанную композицию.

Штаммы Lactobacillus mucosae, клеточные фракции и композиции по изобретению можно использовать при лечении или предупреждении состояний, включающих дисфункции кишечного барьера, в частности состояний, связанных с повышением проницаемости кишечного барьера.

Настоящее изобретение будет понятным более ясно из дальнейшего описания, которое относится к примерам, иллюстрирующим характеристику и свойства штамма Lactobacillus mucosae CNCM I-4429.

ПРИМЕР 1. МОРФОЛОГИЯ И ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ СПОСОБНОСТИ ШТАММА LACTOBACILLUS MUCOSAE CNCM I-4429

Морфология

На фиг. 1 представлены полученные методом электронной микроскопии изображения штамма CNCM I-4429.

Штамм CNCM I-4429 встречается в скрученной форме; это скрученная бацилла.

Анализ углеводного метаболизма

Анализ ферментации сахаров проводили на аппарате Bioscreen (OyGrowthCurvesAbLtd). Для анализа выбирали 21 сахар. Они перечислены в таблице I.

Анализ, проведенный на Bioscreen, продолжался двадцать четыре часа, измерение проводили каждые 20 минут через 10 секунд встряхивания. Анализ проводили дважды в трех повторениях. Чтобы избежать катаболитический эффект репрессинга глюкозы применяли прекультуральную среду с галактозой.

- Среда прекультуральной MRS-галактозы;

- Среда культуры, MRS с 1% сахара тестированный в каждой лунке;

- 300 мкл среды и 1% прекультуры;

- OD измеряли каждые 20 минут в течение 24 часов через 10 секунд встряхивания.

Контрольную пробу представляли посредством MRS без бактерий.

Результаты представлены в таблице I ниже: (+) для присутствия роста, (±) для умеренного роста и (-) для отсутствия роста. Рост считали положительным, когда OD достигал 0,8 или более.

Результаты

Штамм Lactobacillus mucosae CNCM I-4429 имеет специфический паттерн метаболизмов сахара. Паттерн является совершенно отличным от паттернов штаммов L. Rhamnosus или L. paracasei. Два сахара не метаболизируются совсем: мелицитоза и дульцит.

Три сахара являются слабо и недавно метаболизированными: галактозамин, мио-инозитолисорбит. Четыре сахара являются метаболизированными, но недавно: маннит, целлюлоза, сорбоза и фруктоза.

ПРИМЕР 2. СВОЙСТВА СВЯЗЫВАНИЯ СО СЛИЗЬЮ ШТАММА LACTOBACILLUS MUCOSAE CNCM I-4429

Адгезия к муцину

Анализ адгезии к муцину из желудка свиньи тип II (Sigma Aldrich) проводили посредством двух протоколов для исследования образования биопленки, "статического" и "динамического".

Первые и последние этапы подготовки для обоих протоколов были одинаковыми. Муцин растворяли в PBS pH 7, в концентрации 20 мг/мл, затем стеклянные шарики, стерилизованные теплом (6 мм в диаметре), погружали в раствор муцина, инкубировали в течение 1 часа при 37°C и затем оставляли в течение ночи при 4°C. На следующие сутки шарики отмывали дважды в PBS pH 7.

Для "статического" протокола шарики погружали в 1 мл выращенной за ночь культуры L. Mucosae, выращенной в MRS+ глюкоза/MRS+ рибоза, и инкубировали 4 часа при 37°C, тогда как в динамической модели каждый штамм инкубировали со стеклянными шариками в течение 1 часа при 37°C перед началом.

Динамическая модель для изучения образования биопленки была составлена из двух раздаточных гребенок с 5 зубцами (Sarstedt S.R.L., Verona, Italia), соединенных друг с другом посредством пластиковой трубки, элементов соединения (PF 0052) и коротких сточных камер (PF 0047), оснащенных верхними крышками с одним входом (PF 0146), (Industrie Borla S.p.A., Moncalieri, Italia). Все компоненты были предварительно стерилизованы посредством погружения в этанол (50%), и их сборка с гребенкой происходила в стерильных условиях. Во всех тестах применяли три камеры, заполненные культурой, и 3 стеклянных шарика. Бульон MRS (Oxoid), разбавленный в воде (50%) и к которому добавляли ванкомицин (4 мкг/мл), применяли в качестве среды для получения постоянного потока (посредством гравитации) в камерах в течение 24 часов. Температуру в камерах поддерживали на уровне 37°C посредством применения внешней водяной бани. Затем шарик был удален в асептических условиях (в динамической модели дважды: после 1ч - T0 и в конце инкубации - T24), промыт дважды в физиологическом растворе для удаления неприкрепившихся клеток, погружен в 1 мл физиологического раствора и встряхивали в течение 1 минуты для высвобождения прикрепившихся клеток в растворе. Затем получали десятичное разведение и 100 мкл каждого разведения рассеивали в чашке Петри, содержащей агарозную среду MRS (Man, Rogosa, Sharpe).

Десятичные разведения получали также из выращенных за ночь культур для статического протокола и из среды, присутствующей в камерах - планктонные клетки (в динамическом протоколе), чтобы определить число прикрепившихся клеток. Чашки инкубировали при 37°C в течение 24 часов в анаэробных условиях.

Результаты представлены в Таблице II ниже.

Адгезия к слизи штаммов L. Mucosae (динамический анализ)

Эти результаты показывают, что штамм Lactobacillus mucosae CNCM I-4429 имеет более высокую адгезию к слизи при сравнении с двумя другими штаммами L. mucosae.

Адгезия к клеточным монослоям

Оценку адгезии к монослоям Caco2 и HT29 проводили дважды в двух повторах. Анализы состояли из 90 мин инкубации штаммов L. mucosae (10⁷ КОЕ - 10⁸ КОЕ) с монослоем клеточных линий, состоящих из 500000 клеток. Штаммы L. Mucosae предварительно окрашивали в течение 30 минут посредством флуоресцентного зонда 6CFDA. В конце времени инкубации монослои осторожно промывали и прикрепившиеся клетки микроорганизмов лизировали, чтобы подсчитать уровень флуоресценции и определить число клеток, прикрепившихся к эпителию.

Результаты представлены в таблице III ниже

Клетки Caco-2

ПРИМЕР 3. ПРОТИВОМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММА LACTOBACILLUS MUCOSAE CNCM I-4429

Для этих тестов использовали способ "наложения", описанный в литературе (CHARTERIS et al., J Food Prot, 61, 1636-43, 1998; TOMINAGA & HATAKEYAMA, Appl Environ Microbiol, 72, 1141-7, 2006).

Культуры 11 ч, 18 ч и 48 ч Lactobacillus mucosae CNCMI- 4429 в глюкозосодержащей среде центрифугировали, и кислый pH супернатанта (~pH 4) корректировали с использованием 2M NaOH до pH6,5. Таким образом, молочную кислоту нейтрализовали и диссоциировали, что убирало ее токсичность. Тесты "наложения" проводили в планшетах. Применяемой средой была сердечно-мозговая вытяжка-BHI (Difco) 0,7% мягкий агар, инокулированный выращенной в течение ночи культурой Salmonella enterica. Когда поверхность среды после инокуляции сушили, в каждом планшете в 4 лунках пробивали отверстия диаметром 5 мм. Затем 80 мкл супернатанта, не содержащего клетки (со скорректированным pH и нескорректированным для сравнения), L. Mucosae помещали в каждую лунку.

Планшеты инкубировали 24 часа в анаэробных условиях при 37°C. Результаты визуализировали и делали фотографии планшетов. Эксперименты повторяли, по меньшей мере, дважды, большей частью трижды.

Результаты репрезентативного проведения опытов с культурой 16 часов представлены на фиг.2: слева и наверху ингибирование роста Salmonella enteric посредством супернатанта L. Mucosae при pH 4; справа и наверху ингибирование роста патогена посредством нейтрализованного супернатанта L. Mucosae (pH 6,5). Внизу ингибирование роста Salmonella enteric посредством супернатанта L. Paracasei при pH 4 (слева) и pH 6,5 (справа).

Для L. mucosae размеры зоны ингибирования составляют: при pH 4=18 мм и при pH 6,5=16 мм. Для L. Paracasei размеры зоны ингибирования: при pH 4=16 мм и при pH 6,5=3 мм.

Эти результаты показывают, что L. Mucosae CNCM I-4429 демонстрирует очень сильное ингибирование роста патогенна Salmonella enterica.

ПРИМЕР 4. ЭФФЕКТ ШТАММА LACTOBACILLUS MUCOSAE CNCM I-4429 НА ТРАНСЭПИТЕЛИАЛЬНУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК КИШЕЧНИКА

Эффект штамма CNCM 1-4429 на трансэпителиальную устойчивость монослоя эпителиальных клеток кишечника Caco2 сравнивали с эффектами различных штаммов L. Casei и L. Rhamnosus, включая штамм L. Casei DN 114001 (CNCM 1-1518) и штамм L. Rhamnosus LGG, оба из которых известны своей способностью уменьшать проницаемость эпителиального барьера кишечника (DONATO et al., 2010 и EUN et al., 2010, цитированные выше).

Способы

Применяли клетки Caco2. Эти клетки способны образовывать монослой в условиях in vitro.

Клетки выращивают в минимальной среде Игла (модифицированная Dulbecco/VogtDMEM, Invitrogen), содержащей 10% сыворотки (BioWhittaker), 1% аминокислот (Invitrogen) и 1% пенициллин/стрептомицина (10000 Ед/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, Invitrogen). Клетки поддерживают при 37°C в инкубаторе с влажной атмосферой с 5% CO₂.

Дважды в неделю клетки отмывают посредством буфера PBS без кальция и магния и разбавляют в свежей среде. Затем клетки снимают трипсином (Trypsine Invitrogen). Жизнеспособность клеток проверяют посредством теста исключения трипанового синего. 4 миллиона клеток помещают в специальные матрасы для культивирования клеток размером 75 см² (TPP).

Планшеты с трансвелыми (Sigma) инокулируют посредством 10⁵ клеток в 0,5 мл среды в обоих отсеках.

Параллельно бактерии культивируют в течение 16 часов при 37°C в среде MRS.

Через 6 суток инкубации клеток, когда TEER составляет >1300 омега, бактерии приводят в контакт с клетками. 10⁶ КОЕ бактерий для тестирования, добавленные к верхнему отсеку камер с трансвелами, инкубируют с клетками в течение 24 часов. Для экспериментов, проведенных в присутствии TNF-α, его добавляют в нижний отсек камер с трансвелами в концентрации 10 нг/мл, через 3 часа после бактерий. В качестве контроля применяют камеру с трансвелом без добавления бактерий.

TEER измеряют в камерах с трансвелами посредством вольтметра Evom² (World Precision Instruments) при T₀ и T₂₄. Опыт повторяли 3 раза независимым образом. Эволюция TEER в течение эксперимента представлена в качестве соотношения:

[TEER24ч/TEER t0 клетки, обработанные бактериями]/ [TEER24ч/TEER t0 контроль].

Результаты

Результаты представлены на фиг.3 и 4.

На фиг.3 представлены эффекты бактерий, тестированных на трансэпителиальную устойчивость клеточного монослоя в исходных условиях. На фиг.4 представлены их эффекты на трансэпителиальную устойчивость клеточного монослоя после его дестабилизации посредством TNF-α. L.c указывает на штаммы L.casei, L.c 01 является штаммом CNCM 1-1518; L.rh указывает на штаммы L. rhamnosus, L. rh 35 является штаммом LGG; L.m 15 представляет L. Mucosae CNCM I-4429; контроль идентифицирован.

Результаты фиг.3 представляют, что в исходных условиях L. mucosae CNCM I-4429 усиливает трансэпителиальную устойчивость приблизительно на 21%. При тех же экспериментальных условиях L. rhamnosus LGG усиливает ее приблизительно на 31%, и L. casei CNCM I-1518 усиливает ее приблизительно на 13%.

Результаты на фиг.4 представляют, что после дестабилизации посредством TNF-α трансэпителиальная устойчивость контрольного монослоя понижается на 14% при сравнении с исходными условиями. В противоположность этому, в клетках, инкубированных с L. mucosae CNCM I-4429, трансэпителиальная устойчивость усиливается приблизительно на 8% при сравнении с исходными условиями. При тех же экспериментальных условиях L. rhamnosus LGG усиливает ее приблизительно на 16% и L. casei CNCM I-1518 усиливает ее приблизительно на 5%.

ПРИМЕР 5. ЭФФЕКТ ШТАММА LACTOBACILLUS MUCOSAE CNCM I-4429 НА РАСПРОСТРАНЕНИЕ ZO-1 В МОНОСЛОЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК КИШЕЧНИКА

ZO-1 является внутриклеточным поддерживающим белком плотных контактов, который играет важную роль в целостности плотных контактов и непроницаемости TJ эпителия.

Распространение ZO-1 в клеточных монослоях Caco2, применяемых в примере 4, изучали посредством иммунофлуоресценции, в исходных условиях или после обработки TNF-α с или без предварительной инкубации с лактобактериями, как описано в примере 4. Эффект L.mucosae CNCM 1-4429 на субклеточное распространение ZO-1 сравнивали с эффектом штамма Lactobacillus casei L.c 21, который не имеет эффекта на повышение трансэпителиальной устойчивости (фиг.4).

Результаты показаны на фиг.5: A: клеточный монослой Caco2 в исходных условиях; B: клеточный монослой Caco2, обработанный TNF-α; C: клеточный монослой Caco2, обработанный TNF-α в присутствии L.c 21; D: клеточный монослой Caco2, обработанный TNF-α в присутствии CNCM 1-4429.

В исходных условиях ZO-1 в основном локализован на мембране клеток; обработка посредством TNF-α вызывает дезорганизацию ZO-1, доказанную присутствием внутрицитоплазматических структур. Эти структуры также присутствуют в обработанных TNF-α клетках, инкубированных с L.c 21, в то время как клетки, обработанные TNF-α, инкубированные с CNCM I-4429, демонстрируют почти тот же паттерн распространения ZO-1,как клетки в исходных условиях.