Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемолизина Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli - суперпродуцент прогемолизина Vibrio cholerae

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и может быть использовано для получения препаратов гемолизина (HlyA) Vibrio cholerae в целях создания специфических диагностикумов, а также для изучения свойств, биохимической и биологической активности гемолизина (HlyA) Vibrio cholerae.

Растворимый гемолизин/цитолизин (HlyA) является одним из факторов патогенности/персистенции холерных вибрионов Эль Тор. В связи с этим способность к его продукции до настоящего времени используют в качестве показателя отсутствия эпидемической опасности возбудителей. Обычно гемолитичность штаммов проверяют в пробе Грейга. Данный метод имеет ряд существенных недостатков в связи с нестандартностью и необходимостью постоянно иметь в распоряжении свежие эритроциты барана, что возможно далеко не во всех диагностических лабораториях, а консервированные, как показывает практика, дают нестабильные результаты. Это обусловливает актуальность разработки альтернативных диагностикумов на основе специфических антител. В свою очередь, для их создания требуются препаративные количества искомого антигена, наиболее эффективным способом получения которого остается использование лабораторных штаммов E.coli, содержащих и экспрессирующих клонированный ген hlyA.

Продуктом гена hlyA является белок proHlyA (прогемолизин), который в дальнейшем подвергается протеолитическому процессингу с образованием зрелой формы HlyA. Рекомбинантные штаммы кишечной палочки, в отличие от холерных вибрионов, такой процессинг не осуществляют, и синтезируемый ими конечный продукт находится в форме прогемолизина, который, тем не менее, обладает гемолитической активностью.

Известна рекомбинантная плазмида рРМ431, экспрессирующая клонированный в составе векторной плазмиды pBR322 ген hlyA Vibrio cholerae 017 в штамме E.coli K-12/LE392 рРМ431 [1], который использовали в научных исследованиях для картирования hly-локуса.

Недостатком плазмиды рРМ431 является то, что она содержит большой фрагмент длиной 6,2 т.п.н., включающий, помимо гена hlyA, также гены hlyB и hlyC (НрА), что предполагает наличие в клетках кишечной палочки нецелевых продуктов, которые затрудняют выделение и очистку целевого продукта. Кроме того продуктивность штамма как продуцента HlyA не изучалась.

За прототип выбраны рекомбинантная плазмида pSG1012, экспрессирующая клонированный в составе векторной плазмиды pBR322 ген hlyA Vibrio cholerae RV79, и несуший ее штамм E.coli K-12pSG1012 [2]. Плазмида pSG1012 содержит фрагмент ДНК Vibrio cholerae длиной 3,6 т.п.н., включающий ген hlyA (2,3 т.п.н.), экспрессирующийся под контролем собственного промотора.

Однако плазмиду использовали в качестве источника hlyA-специфичного молекулярного зонда для блот-гибридизации с ДНК холерных вибрионов, а не для получения препарата прогемолизина, что не входило в задачи исследования, поэтому продуктивность штамма E.coli K-12pSG1012 не изучалась.

Недостатком обоих этих штаммов является неконтролируемая экспрессия гена hlyA и сравнительно невысокий выход искомого белка, для выделения которого в препаративных количествах потребуется наращивание продуцентов в больших объемах.

Техническая задача изобретения - клонирование гена hlyA в составе плазмидного вектора pQE30, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем мощного Т5-промотора, и создание штамма E.coli - суперпродуцента рекомбинантпого белка proHlyA V.cholerae для выделения искомого продукта в препаративных количествах из минимальных объемов биомассы.

Задача решается путем создания:

- новой рекомбинантной плазмиды pHlyA, экспрессирующей клонированный ген hlyA холерного вибриона в штаммах кишечной палочки.

- штамма Escherichia coli M15[pREP4]pHlyA - суперпродуцента прогемолизина холерных вибрионов посредством трансформации штамма Е. coli M15[pREP4] рекомбинантной плазмидой pHlyA.

На фиг. 1 представлена схема конструирования рекомбинантной плазмиды pHlyA.

Векторная плазмида pQE30 несет ген устойчивости к ампициллину (bla) и содержит промоторно-операторную область, включающую Т5-промотор и два расположенных тандемом lac-оператора, обеспечивающих максимальную репрессию синтеза HlyA в присутствии глюкозы, а также синтетический сайт связывания рибосомальной РНК, старт-кодон, последовательность триплетов, кодирующих синтез гексагистидина (6-His), полилинкер (MCS) и два терминатора транскрипции (t0 фага лямбда и Т1 из rrnB-оперона Е. coli). Экспрессия клонированных генов происходит при индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ) и начинается с плазмидного старт-кодона, при этом образуется гибридный белок, перед первой аминокислотой которого располагается гексагистидиновый блок.

Плазмида pHlyA представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем встраивания в вектор pQE30 гена hlyA V.cholerae O1 биовара eltor (см. фиг. 1).

Будучи трансформирована в штамм кишечной палочки M15[pREP4], рекомбинантная плазмида экспрессирует клонированный ген под контролем Т5-промотора. Экспрессия гена подавляется в присутствии глюкозы и индуцируется ИПТГ.

Штамм E.coli M15[pPvEP4]pHlyA представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем трансформации рекомбинантной плазмиды pHlyA в штамм E.coli M15[pREP4], и является продуцентом proHlyA V.cholerae. Штамм, депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Рос-НИПЧИ «Микроб» под номером КМ 2028.

Полученный штамм-продуцент характеризуется следующими признаками:

Культуралыю-морфологические свойства

В жидких питательных средах (бульоне Хоттингера, мясо-пептонном бульоне) образует равномерную муть, на плотных - круглые, выпуклые, гладкие, белые полупрозрачные колонии с ровным краем, тестообразной консистенции.

Физиолого-биохимические свойства

Штамм разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу и маннит, не разлагает сахарозу, на среде Эндо образует лактозонегативные колонии. Ауксотроф.

Гемолитическая активность: на агаре LB, содержащем 2% эритроцитов барана, 50 мкг/мл ампициллина и 1 мМ ИПТГ, образует отчетливые зоны гемолиза.

Устойчивость к антибиотикам

Штамм устойчив к 25-30 мкг/мл канамицина, что является следствием присутствия в исходном штамме плазмиды pREP4, и к 50-100 мкг/мл ампициллина за счет экспрессии гена bla, находящегося в составе векторной плазмиды pQE30.

Способ получения и использования рекомбинантной плазмиды и штамма-продуцента иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клонирование гена hlyA и получение рекомбинантной плазмиды

Для ПЦР-синтеза гена hlyA используют праймеры, сконструированные заявителями на основе анализа нуклеотидной последовательности гена hlyA (AF220606, AF414369):

прямой - и

обратный - .

Поскольку амплификаты необходимо встроить в плазмидный вектор pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-промотора, на 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонук-леазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и PstI - для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.

Из высокогемолитичного штамма V.cholerae Эль Тор 9337 (Музей живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института) фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза искомого гена.

300 мкл реакционной смеси для полимеразной цепной реакции содержат 0,5 нг ДНК-матрицы и следующие компоненты в указанных концентрациях: по 2,5 мкл каждого праймера, по 2,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 3 ед. Taq-полимеразы и 0,1 объема прилагаемого к ней 10-кратного буфера. Смесь разливают по 30 мкл в 0,5-мл пластиковые пробирки и осуществляют реакцию по следующей схеме: 94°C - денатурация (40 сек), 60°C - отжиг (40 сек), 72°C - синтез (40 сек). Всего проводят 30 циклов амплификации, в последнем цикле время синтеза увеличивают до 3 минут. По окончании реакции содержимое пробирок объединяют, очищают смесью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 и осаждают этиловым спиртом.

Полученный таким образом ПЦР-амплификат длиной 2291 п.н. и ДНК векторной плазмиды pQE30 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и PstI согласно рекомендациям фирмы - изготовителя ферментов, очищают смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждают этиловым спиртом. Осадок растворяют в минимальном объеме деионизованной воды и лигируют с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и прилагаемого к ней буфера согласно рекомендациям изготовителя.

Лигазными смесями трансформируют компетентные клетки E.coli Jml03, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°C - 40 мин, 42°C - 2 мин, 0°C - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB с 0,5% глюкозы, подращивают в течение 1 ч и высевают на агар LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют при 37°C. На следующие сутки выросшие ампициллинрезистентые колонии тестируют с помощью вышеприведенных праймеров и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК и подтверждают наличие вставок длиной ~2,3 т.п.н. гидролизом этих плазмид эндонуклеазами рестрикции BamHI и PstI с последующим электрофорезом в 0,7% агарозном геле.

Из штамма E.coli Jml03pHlyA выделяют плазмидную ДНК и трансформируют ей компетентные клетки E.coli M15[pREP4]. Рекомбинантные клоны отбирают на агаре LB, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 25 мкг/мл канамицина и 0,5% глюкозы.

Пример 2. Изучение экспрессии клонированного гена hlyA в E.coli

В клетках E.coli, в отличие от V.cholerae, гемолизин не подвергается проте-олитическому процессингу и синтезируется в виде прогемолизина (proHlyA). Для выявления способности рекомбинантов к синтезу proHlyA рекомбинантный штамм E.coli M15[pREP4]pHlyA (KM 2028), а также контрольный штамм, содержащий векторную плазмиду pQE30 без вставки, выращивают в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 3-4 ч при 37°C с шуттелированием при 150 об/мин и затем индуцируют 1 мМ ИПТГ в течение 1-2 ч, клетки осаждают центрифугированием, лизируют в буфере, содержащем 65 мМ трис-HCl рН 6,8, 1% SDS и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, при температуре 99°C в течение 10 мин. Лизат подвергают электрофорезу в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS и окрашивают гель Coomassi Blue R250. В лизате выявляется мажорная белковая, полоса в области ~80 кДа, что соответствует молекулярной массе искомого рекомбинантного белка, содержащего на N-конце гексагистидиновый блок. Процентное содержание 6His-белка определяют с помощью программы Quantity One, оно составляет ~13% суммарных клеточных белков штамма M15[pREP4]pHlyA. В лизатах штамма M15[pREP4]pHlyA, выращенного без индукции ИПТГ, и контрольного штамма M15[pREP4]pQE30 независимо от индукции данная мажорная полоса отсутствует (см. фиг. 2А).

Для определения локализации рекомбинантного proHlyA клетки продуцента, выращенного с индукцией, разрушают ультразвуком на дезинтергаторе QSonica Q700 в течение 10 мин (40 импульсов по 5 сек, 357 Дж с перерывами в 10 сек; амплитуда 50) и подвергают электрофорезу растворимую (н/о) и нерастворимую (ос) фракции клеток, разделенных центрифугированием. Искомый белок выявляется в нерастворимой фракции (тельцах включения) штамма M15[pREP4]pHlyA (см. фиг. 2Б), где его содержание составляет ~17% суммарных белков.

Пример 3. Изучение гемолитической активности рекомбинантного белка proHlyA

Известно, что прогемолизин холерных вибрионов обладает гемолитической активностью, хотя и более низкой, чем его зрелая форма. Для подтверждения наличия этой активности штамм M15[pREP4]pHlyA и контрольный M15[pREP4]pQE30 высевают «бляшками» на чашки с агаром LB, содержащим 2% отмытых эритроцитов барана, 50 мкг/мл ампициллина и 1 мМ индуктора ИПТГ и, инкубируют при 37°C. На следующие сутки вокруг макроколоний рекомбинантного штамма образуются отчетливые зоны гемолиза, отсутствующие у контрольного штамма.

Поскольку при выращивании штаммов по примеру 2 некоторое количество гемолизина остается в растворимой фракции, осветленные ультразвуковые дезинтеграты (ОД) клеток вносят в лунки кровяного агара. Спустя 3-4 ч вокруг лунок с ОД опытного штамма образуются отчетливые зоны гемолиза, отсутствующие у контрольного штамма.

Использование рекомбинантной плазмиды pHlyA и штамма E.coli КМ 2028 позволят ускорить процесс выделения белка proHlyA Vibrio cholerae с помощью специфически связывающих бШБ-белки сорбентов в целях создания диагностикумов, а также изучения значимости гемолизина как фактора патогенности/персистенции. В случае необходимости получения зрелой формы HlyA с ММ 65 кДа, обладающей повышенной гемолитической активностью, прогемолизин может быть подвергнут протеолитическому процессингу с помощью обработки трипсином либо гемагглютинин/протеазой V.cholerae [3].

Поскольку proHlyA является единственным токсином, синтезируемым данным штаммом, в качестве препаратов могут быть использованы и неочищенные дезинтеграты бактериальных клеток.

Преимуществами полученного продуцента по сравнению с холерными вибрионами является высокий выход искомого белка, возможность культивирования без соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций, отсутствие способности к синтезу каких-либо дополнительных биологически активных субстанций, которые могли бы затруднить его выделение и очистку, а по сравнению с известными рекомбинантными штаммами-продуцентами - непродолжительный период наращивания биомассы в течение 4-6 часов включая индукцию, что обеспечит возможность ускоренного получения препарата.

Источники информации

1. Manning Р.А., Brown М.Н., Heuzenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) for the haemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 017. Gene 1984; 31(l-3):225-231

2. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor. J.Bacteriol. 1984; 160(1): 239-244

3. Монахова E.B., Писанов P.B., Гончарова Л.А., Михась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов B.C. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli. Биотехнология 2006; 6: 8-15.