ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МЕМБРАННОМУ БЕЛКУ, ОБЩЕМУ ДЛЯ ТСР+ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139 СЕРОГРУПП

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть применено при создании иммуноферментных диагностических тест-систем для идентификации tcp⁺ штаммов V. cholerae O1 и O139 серогрупп.

В настоящее время в лабораторной диагностике холеры актуальной задачей по-прежнему остается разработка новых диагностических средств, позволяющих своевременно обнаружить антигены V. cholerae O1, O139 в исследуемых образцах. Одним из направлений усовершенствования иммунодиагностических препаратов является использование в качестве детектирующих антител специфических моноклональных иммуноглобулинов (МКА), продуцируемых стабильными гибридными клеточными линиями.

Известен способ получения кроличьей сыворотки, содержащей антитела к токсин-корегулируемым пилям адгезии (ТКПА) холерных вибрионов O1 серогруппы [1], заключающийся в дифференциации культур V. cholerae по наличию или отсутствию синтеза ТКПА методом иммунодот- и иммуноблот-анализа, при этом для работы сыворотку необходимо адсорбировать двукратно живыми и двукратно убитыми бактериями, не содержащими TCP. Однако сыворотка была протестирована только на штаммах холерного вибриона классического биовара. На штамме Е. coli обнаружены следы присутствия белков, реагирующих с этими сыворотками.

Известен тест в формате «сэндвич»-ИФА на нитроцеллюлозной мембране [2], где в качестве реагентов используются кроличьи антитела к мембранному белку OmpW, а также два МКА, направленных к рекомбинантному мембранному белку r-OmpW и холерному токсину r-CtxB. Диагностикум позволяет выявлять не менее 60 пг CtxB/мл^-1, 10⁴ КОЕ/мл^-1 холерных вибрионов, но не предназначен для обнаружения эпидемически значимых штаммов V. cholerae O1 и O139 с генотипом ctx^-tcp⁺.

Наиболее близким решением поставленной задачи является способ получения гибридом-продуцентов, синтезирующих МКА к токсин-корегулируемым пилям адгезии [3], в данном исследовании охарактеризовано два МКА - они взаимодействуют с антигеном 24 кДа, продуктом гена tcp El Tor, причем одно из МКА селективно взаимодействует с большой субъединицей пилей (ТерА) вибрионов El Tor и O139, в то время как второе МКА перекрестно реагирует с субъединицей ТсрА классических вибрионов.

Данный способ предусматривает необходимость получения и очистки рекомбинантной субьединицы ТсрА для проведения иммунизации мышей BALB/c. Специфические МКА не рассматриваются в качестве диагностических реагентов, которые могли быть использованы для анализа широкого набора штаммов холерных вибрионов.

Технической задачей предлагаемого изобретения является изыскание штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующего диагностически значимые моноклональные антитела к эпитопам мембранного белка холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп.

Поставленная задача достигается получением штамма культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L. ГХ-H2F6/Omp - продуцент моноклональных антител, специфичных к мембранному белку холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, депонированный под номером Н-61 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Способ получения штамма включает несколько этапов.

I - получение иммунных спленоцитов. Мышей линии BALB/c, иммунизируют взвесью цельных клеток штамма Vibrio cholerae El Tor 13020 (из коллекции Музея живых культур Ростовского-на-дону противочумного института), убитых нагреванием (100°C, 15 мин, проверка на специфическую стерильность). Иммунизацию мышей проводят трехкратно с интервалом 2 недели, вводят внутрибрюшинно 0,2 мл инактивированной взвеси холерных вибрионов (10⁹ кл/мл) в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ, Calbiochem) 1:1, затем с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ, Calbiochem) 1:1, для бустерной иньекции вводят микробную взвесь с физиологическим раствором 1:1. В стерильных условиях извлекают селезенку мышей через 3 дня после заключительной инъекции антигена, растирают в гомогенизаторе и готовят суспензию спленоцитов в бессывороточной среде RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen).

II - проведение гибридизации. Клетки перевиваемой миеломы Р3-X63/Ag8.653 (получена из Коллекции культур клеток позвоночных ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) гибридизуют с иммунными клетками селезенки в соотношении 5:1 в 50% растворе полиэтиленгликоля (Mr 1500, Fluka) на среде RPMI 1640 в течение 1 мин совместной инкубации. Взвесь клеток центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, после этого супернатант декантируют, осадок клеток осторожно ресуспендируют в селективной среде состава: RPMI 1640, 20% сыворотки плода коровы (HyClone, Thermo Scientific), 4 mM 1-глютамина (Amimed), компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина, Gibco).

III - культивирование гибридом. Суспензию слившихся клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета (Cellstar, Greiner bio-one) на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 клеток на лунку, и культивируют при 37°C в СО₂-инкубаторе (Nuaire). Видимые колонии гибридных клеток мышей появляются на 7-10 день. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ. После чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов.

IV - скрининг гибридом. Культуральные жидкости гибридом периодически отбирают из лунок для тестирования в ИФА.

V - клонирование. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.

Штамм ГХ-H2F6/Omp депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора под номером 179 (от 12.12.2016).

Заявляемый штамм гибридом обладает следующими характеристиками.

Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина. В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.

Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии при 37°C в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 100-150 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800-900 тыс. кл./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, контролируя микроскопически интенсивность роста. Кратность рассева 1:4-1:5. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5%-ного СО₂ 70-80%-ной влажности. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у белых мышей, внутрибрюшинно праймированных пристаном в дозе 0,5 мл/мышь за 14 дней до введения гибридомы, осуществляют путем инокулирования 5-10 млн гибридных клеток на одно животное. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 20-30 дней в объеме 2-5 мл. Культуру клеток поддерживали в течение двух пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения)

Кариологические признаки. Модальное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии P3-X63/Ag 8.653. Кариотип клеток штамма ГХ-H2F6/Omp по видовой принадлежности - мышиный.

Биотехнологическая характеристика полезного продукта. МКА относятся к изотипу IgG. Методом иммуноблоттинга установлено, что гибридома ГХ-H2F6/Omp продуцирует специфичные моноклональные антитела к термостабильному белковому антигену, общему для tcp⁺ холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп. Титр специфических иммуноглобулинов в ИФА составляет: в культуральной жидкости (КЖ) 1:800-1:1000, в асцитической жидкости (АЖ) - 1:200000. МКА выявляют эпитоп мембранного белка (м.м. 40 кДа) tcp+ штаммов холерных вибрионов 01 и O139 серогрупп, не давая перекрестных реакций с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90% и криопротектора диметилсульфоксида - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева: гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°C и затем опускают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1⋅10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.

Исследование специфичности МКА. Моноклональные антитела из КЖ выделяют преципитацией сульфатом аммония [4]. Для определения специфичности МКА, продуцируемых гибридомой, используют набор штаммов холерных вибрионов 01 и O139 серогрупп, (из коллекцииМузея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института) представителей рода Aeromonas, Salmonella spp., штаммы V. cholerae не O1/не O139, Е. coli. В качестве антигенных препаратов в исследуемых серологических реакциях используют убитые кипячением бактериальные клетки холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и близкородственных микроорганизмов.

Пример 1. Получение МКА из штамма гибридом ГХ-H2F6/Omp

Гибридому выращивают in vitro до конечной концентрации 1⋅10⁶-5⋅10⁵ кл./мл среды. Клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость с содержащимися в ней МКА собирают, клетки используют для последующего пассажа in vitro. Бесклеточный супернатант используют в виде МКА для подтверждения специфической активности на штаммах холерных вибрионов, а также для выделения моноклональных антител путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония, которые можно длительно хранить в условиях низкотемпературного холодильника без потери специфической активности. На их основе представляется возможным разработка новых иммуноглобулиновых препаратов и тест-систем для лабораторной диагностики холеры.

Пример 2. Подтверждение специфической активности МКА штамма как диагностического реагента в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА)

МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp специфически взаимодействуют со штаммами V.cholerae El Tor и O139, имеющими ген tcp, что подтверждается при проведении непрямого ИФА. Постановку реакции осуществляют следующим образом: в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа (Greiner bio-one) вносят по 10⁸ микробных клеток V. cholerae O1 13020, убитых кипячением, в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9.0, и выдерживают при температуре 37С° в течение 2 часов или при +4°C в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки супернатант культуральной жидкости гибридомы ГХ-H2F6/Omp (полученный как в примере 1) в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к IgG белой мыши (BioRad) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 40 минут, затем 2 раза отмывают лунки раствором ФСБ-Т и один раз дистиллированной водой. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора на основе тетраметилбензидина (Applichem). Положительную реакцию оценивают по появлению сине-голубого окрашивания. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 1 М серной кислоты. Учет результатов проводят на спектрофотометре (BioTek, США) для ИФА при длине волны 450 нм (референс-волна 630 нм). Результаты реакции представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp положительно взаимодействуют со всеми культурами V.cholerae El Tor и O139, имеющими ген tcp⁺, и не взаимодействуют со штаммами холерных вибрионов 01, O139 серогруппы с генотипом tcp^-. Специфичность МКА в отношении холерных вибрионов O1, O139 серогрупп подтверждается отрицательной реакцией в ИФА с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов.

Пример 3. Определение эпитопной направленности МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp методом иммуноблоттинга

Определение эпитопной направленности МКА, продуцируемых штаммом, проводят с использованием в качестве антигена взвесей клеток холерных вибрионов, обеззараженных кипячением. Электрофорез образцов по Laemmli U.K. [5] в пластинах 12,5% полиакриламидного геля размером 70×100×0,7 мм проводят в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) при постоянном напряжении на приборе Mini-Protean Tetra System («Bio-Rad Laboratories, inc.» (США). Полусухой перенос образцов из геля на нитроцеллулозную мембрану (НЦМ) с диаметром пор 0,45 μм осуществляют на приборе Trans-Blot Turbo Transfer System («Bio-Rad Laboratories, inc.», США) с использованием буфера для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 20% этанол, рН 8,3), после чего мембраны высушивают. Постановку иммуноблоттинга проводят, как описано Н. Towbin et al. [6]. Свободные сайты НЦМ блокируют 1% раствором БСА (Albumin bovine, Amresco) при 37°C в течение 30 мин. После 3-кратной отмывки ФСБ - Т НЦМ инкубируют 1 час с препаратом МКА в рабочем разведении при комнатной температуре на ротационном встряхивателе. Затем мембрану отмывают и проявляют конъюгатом кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (Invitrogen) - инкубация 40 минут при комн. температуре на ротационном встряхивателе. НЦМ 3-кратно отмывают в ФСБ-Т, затем помещают в хромогенную смесь на основе 3,3-диаминобензидин-4-гидрохлорида (ДАБ) («Serva»). После проявления специфических полос на мембране реакцию останавливают промыванием блота в дистиллированной воде. При проведении электрофореза используют белковые маркеры молекулярных весов от 10 до 250 кДа (BioRad). На фото 1 представлены результаты иммуноблоттинга: 1 - маркеры молекулярных весов (кДа), 2 - V. cholerae El Tor 13020 (ctx⁺ tcp⁺), 3 - V. cholerae El Tor 19091 (ctx^- tcp^-), 4 - V. cholerae O139 16077 (ctx⁺ tcp⁺). Вывод: на блотограмме видно, что МКА ГХ-H2F6/Omp выявляют у tcp⁺ штаммамов V. cholerae O1 и O139 специфический эпитоп в виде интенсивной полосы, локализованной на уровне маркерных белков 38-42 кДа, что соответствует, по данным литературы, белкам наружных мембран OmpT и OmpU (мол. масса 40 и 38 кДа). При этом, у штамма V. cholerae O139 16077 tcp⁺ выявляются несколько дополнительных полос в диапазоне 20-37 кДа. Специфический для МКА ГХ-H2F6/Omp эпитоп не обнаруживается у штамма V. cholerae El Tor 19091 с генотипом tcp^-.

Пример 4. Определение специфической активности МКА ГХ-H2F6/Omp в отношении tcp⁺ штаммов V. cholerae O1 и O139 методом дот-ИФА

Постановку реакции осуществляют в несколько этапов: первоначально на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) с диаметром пор 0,2 мкм («Schleicher&Schuelle») наносят обеззараженные кипячением и приготовленные на карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,5) взвеси исследуемых культур (10⁹ м.кл./мл) в объеме 4 мкл на точку. Все манипуляции с мембранами проводят с помощью анатомического пинцета, не касаясь ее руками. Затем высушивают мембрану на воздухе при комнатной температуре с последующей отмывкой НЦМ от несвязавшегося антигена в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ - Т) трехкратно. Следующим этапом блокируют свободные сайты 1%-ным раствором БСА (Albumin bovine, Amresco) в течение 30 мин на ротационном встряхивателе. После этого инкубируют НЦМ в растворе антител в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе, отмывают мембрану трехкратно ФСБ - Т. Инкубируют НЦМ в растворе антимышиного пероксидазного конъюгата в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе, отмывают ФСБ-Т трехкратно. Далее, погружают мембрану в активированный раствор хромогенной смеси на основе 3,3-диаминобензидин 4-гидрохлорида (ДАБ) («Serva») до момента проявления специфических точек-дотов. Останавливают реакцию промыванием мембраны в дистиллированной воде. Визуальный учет реакции: за положительный результат принимают четко окрашенные коричневые пятна (см. фото 2). На фото 2 изображена специфическая активность МКА штамма TX-H2F6/Omp в дот-ИФА: 1-5 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx⁺ tcp⁺, 6-10 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx^- tcp⁺, 11-17 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx^- tcp^-, 18-22 - Vibrio cholerae O139 ctx⁺ tcp⁺, 23-26 - Vibrio cholerae O139 ctx^- tcp^-, 27 - Vibrio cholerae O22, 28 - Salmonella spp., 29 - E. coll Результаты дот-ИФА позволяют наглядно увидеть, что МКА штамма ГХ-H2F6/Omp только с культурами V.cholerae O1 и O139 tcp+ образуют на НЦМ интенсивно окрашенные пятна. Положительная реакция не регистрируется с холерными вибрионами, не содержащими гена tcp.

Пример 5. Получение пероксидазного конъюгата на основе МКА штамма ГХ-H2F6/Omp. Источником МКА служили культуральные жидкости, накопленные при многократном пассировании гибридомы-продуцента ГХ-H2F6/Omp

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [4] с последующим диализом. В осажденных препаратах определяли концентрацию белка по Лоури. Конъюгацию очищенных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена проводили по методу Nakane Р.К. [7] в соотношении 2:1 соответственно. Рабочий титр полученного конъюгата определяют в прямом ТИФА, используя в качестве антигена обеззараженные кипячением клетки V. cholerae El Tor 13020. Полученные таким образом препараты имеют рабочий титр в прямом ТИФА 1:32-1:64, что позволяет оценивать их как высокоактивные в отношении холерных вибрионов.

Таким образом, МКА, секретируемые штаммом гибридных культивируемых клеток TX-H2F6/Omp, могут быть применены как диагностические реагенты для идентификации tcp⁺ холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп человеческого и водного происхождения в иммунологических реакциях: непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) и дот-иммуноферментный анализ (дот-ИФА).

Кроме того, на основе МКА TX-H2F6/Omp могут быть сконструированы пероксидазные конъюгаты, которые позволяют выявлять эпидемически значимые штаммы V.cholerae О1, O139 с генотипом tcp⁺ в прямых иммуноферментных реакциях, что значительно сокращает общее время анализа и исключает необходимость использования дорогостоящих антивидовых конъюгатов.

Штамм может быть использован при создании иммуноферментных диагностических тест-систем для идентификации эпидемически значимых холерных вибрионов в целях лабораторной диагностики в здравоохранении и для проведения научных исследований.

Источники информации

1. Заднова С.П., Топорков А.В., Новикова О.В., Смирнова Н.И. Получение и использование антител к токсин-корегулируемым пилям адгезии. Биотехнология. 2003; 1: 79-84.

2. Tuteja U., Kumar S., Shukla J., Kingston J., Batra H.V. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. J. Med. Microbiol. 2007; 56(Pt 10):1340-5.

3. Falero G., Rodriguez B.L., Rodriguez I., Campos J., Ledon Т., Valle E., Silva Y., Marrero K., Suzarte E., Valmaseda Т., Moreno A., Fando R. Production and characterization of monoclonal antibodies to El Tor toxin co-regulated pilus of Vibrio cholerae. Hybrid Hybridomics. 2003; 22(5):315-20.

4. Кэтти Д., ред. Антитела: Методы. М.: Мир; 1991; кн. 1.

5. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227, №5259: 680-685.

6. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding - Current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72: 313-340.

7. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem Cytochem. 1974; 22: 1084-1091.