Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на токсически активные и неактивные

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к патогенным свойствам чумного микроба, в частности касается молекулярных механизмов его токсического действия и может быть использовано в лабораторной практике для выявления токсигенных штаммов Yersinia pestis.

Известно, что патогенез чумы в любой ее форме представляет собой стадии развития инфекционно-токсического шока, который вызывается действием липополисахарида (ЛПС) возбудителя [1, 2]. Биологически активный полимер ЛПС является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Для проявления токсических свойств ЛПС необходимо его отделение от внешней мембраны бактерий и представление рецепторам иммунокомпетентных клеток макроорганизма в свободной молекулярной форме. В опытах in vitro и in vivo показано, что целые клетки чумного микроба и препараты ЛПС, выделенные из этих культур, обладают различными иммуномодулирующими свойствами [3]. Максимальное воздействие на рецепторный комплекс TLR4/MD2 оказывает свободная форма ЛПС. В то же время эффект действия ЛПС, связанного с бактериальной клеткой, незначителен. Объясняется это тем, что токсически активная часть ЛПС (липид А) жестко фиксирована физико-химическими связями с белками внешней мембраны бактерий, что исключает участие липида А в активации фагоцитарных клеток макроорганизма. Из данных литературы известно, что ЛПС в свободной форме в небольших количествах может высвобождаться в среду при делении клеток при разрушении бактерий в процессе фагоцитоза под действием комплекса белков системы комплемента и от антибиотиков, а также обнаруживается в составе бактериальных везикул [4, 5].

Особенность Y. pestis состоит в том, что источником функционально активной формы ЛПС являются не разрушенные, а живые клетки. По наблюдению клиницистов действие эндотоксина максимально на терминальной стадии инфекции, когда стремительное размножение бактерий сопровождается столь же стремительной интоксикацией, что приводит к развитию септического шока и гибели организма [2, 6, 7, 8, 9]. Процесс отделения ЛПС от клеточной стенки грамотрицательных бактерий как функции живой клетки не изучен. В то же время переход от связанного к свободному состоянию является необходимым условием проявления токсических свойств ЛПС.

В качестве прототипа выбран способ повышения вирулентности бактерий Y. pestis при инкубации клеток в гемолизированных эритроцитах крови человека (см. А.Н. Кравцов, В.И. Тынянова и В.П. Зюзина, журнал «Микробиология, эпидемиология и иммунология», 1993 г., стр. 3-6 [10]), заключающийся в том, что клетки вакцинного штамма Y. pestis EV76 выращивают на плотной питательной среде LB (Difco, США) в течение 24 часов при 37°С, вносят в гемолизированные эритроциты крови человека в количестве 1⋅10⁹ - 1⋅10¹⁰ м.к./мл и инкубируют 3 часа при 37°С, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 12000 об/мин, а супернатанты вводят белым мышам внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл. При этом наблюдалась гибель от 80% до 100% животных в течение 2 суток наблюдения.

Описанный в прототипе и предложенный в настоящей работе методы позволяют судить о присутствии ЛПС в среде инкубации бактерий по ее токсичности для биопробных животных, но механизм воздействия ЛПС на клетки иммунной системы макроорганизма различен.

Способ по прототипу основан на трансформации ЛПС из биологически инертного в токсически активную форму в условиях in vitro. Процесс валиден терминальной стадии инфекции и осуществляется под влиянием биологически активного вещества, присутствующего в гемолизированных эритроцитах крови и тканях паренхиматозных органов млекопитающих. В условиях макроорганизма токсическое действие ЛПС реализуется через рецепторный комплекс TLR4/MD2 фагоцитарных клеток [11] и инициирует развитие инфекционно-токсического шока в организме млекопитающего [12]. Чувствительность метода, определенная для ЛПС вакцинного штамма Y. pestis EV 76, составляет LD₅₀ 520-610 мкг/белую мышь [11]. В случае с D-галактозамином (D-GalN) механизм токсического действия ЛПС на макроорганизм иной - провоспалительный цитокин TNF-α, синтез которого индуцирует ЛПС, активирует специфические рецепторы апоптоза исключительно клеток печени (Fas R), что приводит к гибели гепатоцитов и организма в целом. Чувствительность к ЛПС этого же штамма в условиях D-GalN равна 5-10 мкг/белую мышь [13], т.е. выше в 100 раз.

Эти обстоятельства позволили сформулировать задачу предлагаемого изобретения - определить условия in vitro, при которых бактерии возбудителя чумы способны отделять ЛПС во внешнюю среду в свободной функционально активной форме. В результате возникла необходимость разработки простого и высокочувствительного способа, позволяющего дифференцировать штаммы Y. pestis на токсически активные и неактивные.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка простого высокочувствительного способа моделирования процесса освобождения ЛПС живыми бактериями Y. pestis во внешнюю среду для дифференциации штаммов по признаку их токсигенности.

Поставленная задача достигается тем, что способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на токсически активные и неактивные, включающий выращивание клеток вакцинного штамма на плотной питательной среде, с последующей подготовкой взвеси бактерий, ее инкубированием, осаждением клеток центрифугированием и заражением животных супернатантом, причем взвесь бактерий концентрацией 1×10¹⁰ м.к./мл готовят на физиологическом растворе NaCl для отделения ЛПС во внешнюю среду, которую инкубируют 3 часа при 37°С; затем клетки Y. pestis убивают кипячением в течение 30 минут и осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 12000 об/мин, после чего полученный супернатант отделяют от клеток и в объеме 0,1 мл соединяют с 0,1 мл водного раствора D-GalN, затем вводят полученную смесь внутрибрюшинно белым мышам, при этом конечная концентрация D-GalN равна 15 мг на мышь, учет результатов проводят в течение первых двух суток, если животные погибают, то дифференцируют исследуемый штамм как токсически активный токсигенный и соответственно при отсутствии павших животных делают вывод о неактивности штамма.

Способ осуществляется следующим образом

Для осуществления способа были использован вакцинный штамм Y. pestis EV76 (pMT1, pCD1, pPCP1) и бесплазмидный вариант Y. pestis EV76 (рМТ1^-, pCD1^-, рРСР1^-). Отсутствие интеграции плазмид с хромосомной ДНК подтверждено методом ПЦР с праймерами, комплементарными плазмидным генам caf1 (плазмида pMT1), lcrV (плазмида pCD1) и pla (плазмида рРСР1). Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий под № КМ 1279, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов.

Клетки Y. pestis выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 ч до логарифмической фазы роста. На физиологическом растворе NaCl готовят взвесь бактерий концентрацией 1 10¹⁰ м.к./мл, которую инкубируют далее при 37°С в течение 3 часов. Затем клетки Y. pestis убивают кипячением в течение 30 мин и осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1200 об/мин. Полученный супернатант отделяют от клеток и в объеме 0,1 мл соединяют с 0,1 мл водного раствора D-GalN, затем вводят полученную смесь внутрибрушинно белым мышам, при этом конечная концентрация D-GalN в смеси равна 15 мг на мышь.

Учет результатов проводят по гибели животных в течение первых двух суток наблюдения, что позволяет проводить дифференциацию исследуемого материала по их токсической активности. Если животные погибают, то дифференцируют исследуемый штамм как токсически активный и, соответственно при отсутствии павших животных делают вывод об отсутствии токсической активности штамма.

Преимущества предлагаемого способа:

- во-первых, клетки Y. pestis инкубируются не в дорогостоящих гемолизированных эритроцитах крови человека, а в физиологическом растворе NaCl;

- во-вторых, по прототипу метод предполагает использование авирулентных штаммов чумного микроба, что связано с режимными ограничениями при центрифугировании живых клеток. Кроме того, высокое содержание живых вирулентных клеток в супернатанте, остающихся в супернатанте после центрифугирования (до 1⋅10⁴ м.к./мл), не позволяет дифференцировать действие ЛПС от действия оставшихся клеток Y. pestis. Этап убивания взвеси после 3-часовой инкубации при 37°С позволяет применять предлагаемый нами способ для всех штаммов чумного микроба вне зависимости от степени их вирулентности в соответствии с правилами безопасной работы с микроорганизмами I-II групп патогенности.

- в-третьих, применение D-Gal для сенсибилизации мышей повышает их чувствительность к действию свободной формы ЛПС Y. pestis EV76 в сотни раз [13].

На примерах (1-7) экспериментально установлено, что моделирование процесса отделения ЛПС от клеток Y. pestis EV76 во внешнюю среду зависит от соответствующих условий.

Пример 1. Подтверждающий токсичность для белых мышей супернатантов клеток Y. pestis EV76

Клетки вакцинного штамма Y. pestis EV76 выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 ч до логарифмической фазы роста. На физиологическом растворе NaCl готовят взвесь бактерий концентрацией 1 10¹⁰ м.к./мл, которую инкубируют далее при 37°С в течение 3 часов. Затем клетки Y. pestis убивают кипячением в течение 30 мин и осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 12000 об/мин, после чего супернатант отделяют от клеток. Полученный супернатант в объеме 0,1 мл соединяют с 0,1 мл водного раствора D-GalN (Merck, Германия), содержащего 15 мг препарата, и вводят внутрибрюшинно белой мышке. Каждая группа содержала 10 животных. Контролями служат взвеси живых и убитых кипячением клеток Y. pestis EV76 (1⋅10⁸ м.к./на мышь), препараты высокотемпературного (37°С) ЛПС Y. pestis EV76 и водный раствор D-GalN (табл. 1). О присутствии ЛПС в инокулятах судят по гибели животных в течение первых двух суток наблюдения.

Как следует из приведенных в таблице 1 результатов, супернатант клеток, полученный вышеописанным образом (позиция 1), токсичен для животных, сенсибилизированных D-GalN, и вызывает их гибель в 100% случаев.

Живые клетки Y. pestis EV76 в количестве 1-10⁸ м.к. не вызывают гибели при внутрибрюшинном введении их интактным белым мышам, однако сенсибилизированные D-GalN животные при введении этого же количества клеток Y. pestis погибают в 100%-случаев (позиция 2).

То же количество клеток Y. pestis (1⋅10⁸), убитых кипячением, нетоксично для биопробных животных, как интактных, так и сенсибилизированных D-GalN (позиция 3).

37°-ный ЛПС в дозе 10 мкг/мышь без D-GalN не токсичен, а на фоне 15 мг D-GalN вызывает гибель 100% животных (позиция 4).

Сам по себе D-GalN в дозе 15 мг/мышь не опасен для животных (позиция 5).

Пример 2. Иллюстрирующий токсичность для белых мышей супернатантов убитых клеток Y. pestis EV76

Условия постановки эксперимента отличаются от описанных в примере 1 тем, что клетки Y. pestis EV76 убивают кипячением в течение 30 минут перед 3 часовой инкубацией при 37°С, затем производят те же манипуляции, что и в примере 1.

Контроли те же, что и в примере 1.

Как следует из приведенных в таблице 2 результатов, супернатант убитых клеток, полученный вышеописанным способом (позиция 1), не токсичен для животных, сенсибилизированных D-GalN.

Живые клетки Y. pestis EV76 в количестве 1⋅10⁸ м.к. не вызывают гибели при внутрибрюшинном введении их интактным белым мышам, однако сенсибилизированные D-GalN животные при введении этого же количества клеток Y. pestis погибают в 100%-случаев (позиция 2).

То же количество клеток Y. pestis (1⋅10⁸), убитых кипячением, нетоксично для биопробных животных,как интактных, так и сенсибилизированных D-GalN (позиция 3).

37°-ный ЛПС в дозе 10 мкг/мышь без D-GalN не токсичен, а на фоне 15 мг D-GalN вызывает гибель 100% животных (позиция 4).

Сам по себе D-GalN в дозе 15 мг/мышь не опасен для животных (позиция 5).

Пример 3. Подтверждающий зависимость токсичности для белых мышей супернатантов Y. pestis EV76 от количества микробных клеток, инкубируемых в физиологическом растворе

Условия постановки экспериментов такие же, как в 1 примере, но количество инкубируемых в течение 3 часов при 37°С в физиологическом растворе клеток Y. pestis EV76 варьировало от 1⋅10⁸ до 1⋅10¹⁰ в 1 мл.

Как следует из результатов, приведенных в таблице 3, токсичность супернатантов зависит от количества микробных клеток, инкубируемых в физиологическом растворе. В подобранных нами условиях обнаружена прямая зависимость токсичности супернатанта от количества клеток. 100%-ная гибель животных наблюдалась при концентрации 1⋅10¹⁰ м.к./мл (позиция 3).

Пример 4. Иллюстрирующий зависимость токсичности для белых мышей супернатантов клеток Y. pestis EV76 от времени их инкубации при 37°С

Условия постановки экспериментов такие же, как в 1 примере, но время инкубации взвесей клеток Y. pestis EV76 на физиологическом растворе NaCl варьирует от 0 до 6 часов.

Как следует из результатов, приведенных в таблице 4, токсичность супернатантов зависит от времени инкубации. В подобранных нами условиях время, равное 3 часам (позиция 3), является оптимальным.

Пример 5. Иллюстрирующий токсичность для белых мышей супернатантов клеток Y. pestis EV76, предварительно выращенных на плотной питательной среде при 28°С

Условия постановки эксперимента отличаются от описанных в примере 1 тем, что клетки Y. pestis EV76 выращивают на плотной питательной среде при 28°С в течение 18-24 ч до логарифмической фазы роста, затем производят те же манипуляции, что и в примере 1.

Контроли те же, что и в примере 1.

Как следует из приведенных в таблице 5 результатов, супернатант клеток, предварительно выращенных на плотной питательной среде при 28°С, полученный вышеописанным образом (позиция 1), нетоксичен как для интактных мышей, так и для животных, сенсибилизированных D-GalN.

Живые клетки Y. pestis EV76 в количестве 1⋅10⁸ м.к. не вызывают гибели при внутрибрюшинном введении их интактным белым мышам, однако сенсибилизированные D-GalN животные при введении этого же количества клеток Y. pestis погибают в 100%-случаев (позиция 2).

То же количество клеток Y. pestis (1⋅10⁸), убитых кипячением, нетоксично для биопробных животных, как интактных, так и сенсибилизированных D-GalN (позиция 3).

37°-ный ЛПС в дозе 10 мкг/мышь без D-GalN не токсичен, а на фоне 15 мг D-GalN вызывает гибель 100% животных (позиция 4).

Сам по себе D-GalN в дозе 15 мг/мышь не опасен для животных (позиция 5).

Пример 6. Подтверждающий токсичность для белых мышей супернатантов клеток Y. pestis EV76, предварительно выращенных при 37°С в течение 48 часов до стационарной фазы роста

Условия постановки эксперимента отличаются от описанных в примере 1 тем, что клетки Y. pestis EV76 выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч до стационарной фазы роста, затем производят те же манипуляции, что и в примере 1.

Контроль такой, как в примере 1.

Как следует из приведенных в таблице 6 результатов, супернатант клеток, полученный вышеописанным образом (позиция 1), нетоксичен как для интактных мышей, так и для животных, сенсибилизированных D-GalN.

Живые клетки Y. pestis EV76 в количестве 1-10 м.к. не вызывают гибели при внутрибрюшинном введении их интактным белым мышам, однако сенсибилизированные D-GalN животные при введении этого же количества клеток Y. pestis погибают в 100%-случаев (позиция 2).

То же количество клеток Y. pestis (1⋅10⁸), убитых кипячением, нетоксично для биопробных животных, как интактных, так и сенсибилизированных D-GalN (позиция 3). 37°-ный ЛПС в дозе 10 мкг/мышь без D-GalN не токсичен, а на фоне 15 мг D-GalN вызывает гибель 100% животных (позиция 4).

Сам по себе D-GalN в дозе 15 мг/мышь не опасен для животных (позиция 5).

Пример 7. Иллюстрирующий зависимость токсичности для белых мышей супернатантов клеток Y. pestis EV76 от концентрации D-GalN, применяемой для сенсибилизации биопробных животных

Условия постановки экспериментов такие же, как в 1 примере, но концентрация D-GalN, применяемая для сенсибилизации биопробных животных, варьирует от 7 до 30 мг/мышь.

Как следует из результатов, приведенных в таблице 7, токсичность супернатантов зависит от концентрации D-GalN, применяемой для сенсибилизации биопробных животных. Оптимальное значение равно 15 мг/мышь (позиция 2).

Вывод: установлено (см. примеры 1-7), что процесс отделения ЛПС от клеточной стенки Y. pestis зависит от следующих факторов: температуры выращивания культуры; возраста культуры; нативности культуры - живая или убитая; времени и температуры инкубации взвеси клеток в физиологическом растворе; количества клеток, взятых для инкубации; концентрации аминосахара D-галактозамина (D-GalN), применяемого для сенсибилизации биопробных животных.

Пример 8. Иллюстрирующий токсичность для белых мышей супернатантов клеток различных штаммов Y. Pestis

Условия постановки экспериментов такие же, как в 1 примере с использованием высоковирулентного штамма Y. pestis 231 (pMT1, pCD1, pPCP1), LD₅₀ = 3-20 м.к./белую мышь, и его авирулентный бесплазмидный вариант Y. pestis 231 (рМТ1^-, pCD1^-, pPCP1), (из коллекции ГНЦ ПМБ, г. Оболенск).

Из таблицы 8 видно, что на фоне D-GalN клетки вирулентного штамма Y. pestis 231 токсигенны и вызывают 100%-ную гибель животных (позиция 3). Его авирулентный вариант (позиция 4) атоксигенен и гибели животных не вызывает. Вакцинный штамм Y. pestis EV76 с полноценным набором плазмид токсигенен (позиция 1) и вызывает гибель 100% животных. Его бесплазмидный вариант (позиция 2) токсическими свойствами не обладает.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет дифференцировать штаммы Y. pestis по их токсической активности, выявляя токсигенные и атоксигенные варианты Y. pestis.

Предлагаемое изобретение позволяет моделировать процесс освобождения ЛПС живыми бактериями Y. pestis во внешнюю среду, а сенсибилизация биопробных животных D-GalN повышает их чувствительность к ЛПС чумного микроба в сотни раз.

Эти обстоятельства позволят использовать предлагаемый способ в лабораторной практике для дифференциации и выявления токсигенных штаммов чумного микроба, потенциально способных вызывать инфекционно-токсический шок, что будет способствовать совершенствованию методов лечения чумной инфекции с использованием антитоксических препаратов и специфической иммунотерапии.

Информационные источники

1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. / Анисимов А.П. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2002. - №3. - С. 3-23.

2. Дмитровский А.М. Токсический компонент патогенеза чумного инфекционного процесса: инфекционно-токсический шок. / Дмитровский А.М. // Матер. межгосуд. научн. конф. "Проф. и меры б-бы с чумой", посвящ. 100-лет. откр. возб. чумы. - Алматы, 1994. - С. 15-16.

3. Matsuura М. Immunomodulatory properties of Yersinia pestis lipopolysaccharides on human macrophages / Matsuura M., Takahashi H., Watanabe H. et al. // Clin. Vaccine Immunol. - 2010. - Vol. 17, №1. - P. 49-55.

4. Домарадский И.В. Чума. - M.: Медицина, 1998 - 176 с.

5. Eddy J. Production of outer membrane vesicles by the plague pathogen Yersinia pestis. / Eddy J., Gielda L., Caulfield A. et al. // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, №9: - e107002.

6. Лобанов В.Н. Чума у верблюдов и ее значение в эпидемиологии. - Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1969. - 127 с.

7. Домарадский И.В. Очерки патогенеза чумы. - М.: Медицина, 1966. - 271 с.

8. Matsuura М. Structural Modifications of Bacterial Lipopolysaccharide that Facilitate Gram-Negative Bacteria Evasion of Host Innate Immunity / Matsuura M. // Front Immunol. 2013, May 24, №4 - P. 109-113.

9. Montminy S. Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolysaccharide response / Montminy S., Khan N., McGrath S. et al. // J. Nature Immun. - 2006. - Vol. 7, №10. - P. 1066-1073.

10. Кравцов A.H. Повышение вирулентности бактерий Yersinia pestis при инкубации клеток в гемолизированных эритроцитах крови человека. / Кравцов А.Н., Тынянова В.И., Зюзина В.П. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1993 - №4. - С. 3-6.

11. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба. Автореф. дис … канд. биол. наук: 03.00.07 / Соколова Е.П. - Ростов-на-Дону. 2002. - 20 с.

12. Тынянова В.И. Специфичность иммуномодулирующего действия эндотоксина чумного микроба. / Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В., Соколова Е.П. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2016. - №3. - С. 104-112.

13. Демидова Г.В. Токсичность липополисахаридов вакцинного штамма Yersinia pestis EV 76 для белых мышей, сенсибилизированных D-галактозамином (краткое сообщение) / Демидова Г.В., Зюзина В.П., Соколова Е.П., и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2011. - №1. - С. 74-76.