Способ получения чистой жизнеспособной культуры протосколексов Echinococcus multilocularis

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии. Предложенный способ предусматривает одномоментное выделение чистой культуры жизнеспособных протосколексов Echinococcus multiocularis, которые могут быть использованы для дальнейших биотехнологических, иммунологических исследований и лабораторного моделирования альвеолярного эхинококкоза.

Эхинококкоз (лат. Echinococcosis) - гельминтоз из группы цестодозов, характеризующийся образованием в печени, легких или других органах и тканях паразитарных кист, распространяющихся по организму путем метастазирования. Возбудитель альвеолярной формы эхинококкоза - E.multilocularis относится к числу наиболее патогенных социально опасных гельминтов, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека и являющихся актуальными для ветеринарной медицины. Вызываемое им заболевание - альвеолярный эхинококкоз, характеризуется чрезвычайно тяжелым хроническим течением с первичным поражением печени, нередко сопровождающееся метастазами подобно раковой опухоли в головной мозг, легкие и другие органы. Циста паразита (метацестода, ларвоциста) - это плотный бугристый паразитарный узел, на разрезе имеющий мелкоячеистое строение, часто с полостью распада в центре. Гистологически среди разрастаний грубой соединительной ткани выявляется множество пузырьков альвеококка с протосколексами внутри. Возможно метастазирование, чаще в легкие и головной мозг. Распространение цистного и альвеолярного гидатидоза за последние годы увеличивается по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальной жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля [2, 3, 5].

Эпидемиологическая ситуация по эхинококкозам в РФ по данным Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека остается сложной. Ежегодно в РФ регистрируется свыше 500 случаев эхинококкоза, причем в структуре заболевания 14,5% составляют дети. За трехлетний период (2013-2015 годы) зарегистрировано 174 случая альвеококкоза в 31 субъекте Российской Федерации (Алтайский, Красноярский, Пермский края и др.). Максимальное число случаев альвеококкоза зарегистрировано в Алтайском крае (34 случая); Республике Башкортостан (16 сл); Новосибирской (22 сл.), Кемеровской (13 сл) областях, городе Москва (17 сл.) [4].

Увеличение числа случаев заболевания людей требует немедленной организации методов борьбы и профилактики и становится важной проблемой ветеринарии и здравоохранения. Именно поэтому поиск эффективных методов диагностики, профилактики и лечения этого социально опасного гельминтозооноза был и остается одним из приоритетных направлений гельминтологической науки и практики. Чистая, жизнеспособная культура протосколексов E.multiocularis необходима для получения первичной и перевиваемых культур клеток, для получения антигенов паразита как физико-химическими методами, так и на основе клеточной технологии для проведения иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований при альвеолярном эхинококкозе.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ, описанный Коваленко Ф.П. с соавторами в патенте №1839182 «Способ хранения ларвального альвеококка» от 30.12.1993 [1]. Способ-прототип состоит в следующем. Из фрагментов конгломератов ларвоцист выделяют зародышевые элементы. Для этого ларвоцисты измельчают ножницами, полученные фрагменты смешивают со стерильным раствором хлорида натрия при соотношении фрагментов ларвоцист и физиологического раствора 1:10. Полученную смесь процеживают через мельничный газ (нейлоновую сетку) с диаметром ячеек 1,0 мм. Полученный фильтрат процеживают через мельничный газ с диаметром ячеек 0,3 мм. Затем фильтрат взбалтывают и после 2 мин отстаивания удаляют всю надосадочную жидкость и заменяют ее свежим физиологическим раствором до конечного объема 50 мл. Эту операцию повторяют 5 раз до достижения полной прозрачности надосадочной жидкости.

К недостаткам данного метода следует отнести наличие большого количества биологических отходов-фрагментов ларвоцист, часто содержащих в себе невыделенные жизнеспособные протосколексы паразита, а также наличие поврежденных, малоактивных или нежизнеспособных протосколексов в выделенном осадке. Помимо прочего данный способ обладает большой времяемкостью и на каждом этапе работы требует использования ручного труда, как на этапе выделения инвазивных элементов, - измельчение ножницами, использование мельничного газа различного диаметра ячеек, многократное перетирание и промывание биомассы.

Сопоставительный анализ показывает, что заявляемое техническое решение существенно отличается от прототипа, во-первых, механическим измельчением ларвоцист паразита при помощи электрической мясорубки. Во-вторых, аппаратным способом выделения чистых жизнеспособных протосколексов, а в-третьих, использованием для этих целей искусственного желудочного сока (ИЖС), что позволяет сократить время выделения в 2-2,5 раза и увеличить количество выделенных чистых жизнеспособных протосколексов до 95-98%. Использованные для выделения чистой культуры жизнеспособных протосколексов E.multilocularis методы применены впервые в мире, поэтому данное техническое решение отвечает критерию «новизна».

Целью изобретения является способ получения чистой, жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis, необходимой для приготовления клеточной культуры, получения антигенов паразита различными способами для проведения иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований.

Предлагаемый нами способ включает следующие этапы:

1. Получение эхинококковых ларвоцист.

2. Подготовка полученного биоматериала из ларвоцист E.multilocularis для выделения чистой культуры протосколексов и оценка жизнеспособности выделенных протосколексов.

1. Получение эхинококковых ларвоцист.

Эхинококковые ларвоцисты получали от белых крыс, массой 160-180 г экспериментально зараженных внутрибрюшинно в дозе 1500-2000 инвазивных протосколексов с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл) через 3-4 месяца после заражения. Для этого зараженные животные подвергались эвтаназии (в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».), вскрывались, а ларвоцисты иссекались стерильными хирургическими инструментами и помещались в стеклянные стаканы со стерильным физиологическим раствором комнатной температуры. Полученные ларвоцисты промывались для удаления следов крови, взвешивались и использовались для выделения чистых жизнеспособных протосколексов E.multitocularis.

2. Подготовка полученного биоматериала из ларвоцист E.multilocularis для выделения чистой культуры протосколексов и оценка жизнеспособности выделенных протосколексов.

Ларвоцисты E.multilocularis, выделенные от экспериментально-зараженных крыс, подвергли измельчению через мясорубку с диаметром решетки 3-4 мм. Смешивали с ИЖС из расчета 1:10 (1 г фрагментов ларвоцист на 15 мл раствора) следующего состава: вода водопроводная - 1000 см³ (температура 41-42°C); кислота соляная концентрированная (удельная масса 1,2) - 10 см³; пепсин пищевой - 6,0 г; NaCl - 9,0 г. Приготовленный раствор заливали в реактор аппарата и запускали режим прогревания до 41-42°C (автоматическая предустановленная программа).

Полученную измельченную пробу закладывали в металлическую колбу аппарата «Gastros-2M» и помещали в реактор и прогретый ИЖС. Время экспозиции аппарата в режиме переваривания при постоянном автоматическом перемешивании - 50 минут и постоянной температуре 41-42°C, время отстаивания - 10 минут. Характеристики прибора позволяют одномоментно производить переваривание измельченных ларвоцист E.multiocularis с массой 75-150 г с использованием от одного до двух литров ИЖС.

Полученный перевар представляет собой мутный бульон без крупных оформленных частиц ткани, на дне реактора оставался тонкий белесый осадок и непереваренные фрагменты соединительно-тканной природы, не представляющие ценности. Мутный бульон в объеме 30-50 см³ сливали из реактора по истечении 10-минутного отстаивания. Объем мутного бульона не зависит от первоначальной массы измельченных ларвоцист.

Полученную смесь взбалтывали и после 5 мин отстаивания удаляли всю надосадочную жидкость и заменяли ее свежим физиологическим раствором 37°C до конечного объема 50 мл. После отстаивания в течение 5 минут надосадочную жидкость удаляли автоматическим пипетором Thermo Scientific Finnpipette С1 со сменными одноразовыми пластиковыми пипетками и заменяли свежим физиологическим раствором 37°C с пенициллином и мономицином в концентрации 4000 ед./мл каждого до конечного объема 50 мл. Данная операция повторялась до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной, в среднем 2-3 раза.

Жизнеспособность выделенных протосколексов оценивали путем микроскопии осадка при увеличении объектива 4×10 по их целостности, двигательной активности и наличию/отсутствию инородных примесей. Получение культуры протосколексов эхинококка считается эффективным, если в поле зрения присутствуют не менее 95% жизнеспособных активно двигающихся протосколексов E.multiocularis без включения инородных элементов. Инвазивность определяли биопробой на интактных мышах или крысах.

Примеры конкретного исполнения

ПРИМЕР 1. Получение из чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis антигенов и оценка их диагностической эффективности.

От пяти белых беспородных крыс, экспериментально зараженных внутрибрюшинно инвазивным материалом E.multiocularis в дозе 1500-2000 экз. с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл), получали ларвоцисты E.multiocularis через 3-4 месяца после заражения. Полученные ларвоцисты подвергали измельчению и использовали для получения жизнеспособной чистой культуры протосколексов E.multiocularis по вышеописанной методике (стр. 4-6). Из полученной чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis готовили клеточную культуру с последующим культивированием и получением антигенов протосколексов (патент №2219551 - 2003. Бюл №35). Диагностическую эффективность полученного антигена протосколексов E.multiocularis проверили с 30 пробами сывороток экспериментально зараженных белых крыс, в том числе зараженных E.multiocularis - 12 проб, Trichinella spiralis - 12 проб, Toxocara canis - 6 проб и 10 проб сывороток от интактных крыс. Результаты исследования представлены в таблице.

ПРИМЕР 2. Оценка протективной эффективности полученных антигенов из чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis

От трех белых беспородных крыс, экспериментально зараженных внутрибрюшинно инвазивным материалом E.multiocularis в дозе 1500-2000 экз. с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл), получали ларвоцисты E.multiocularis через 3-4 месяца после заражения. Полученные ларвоцисты подвергали измельчению и использовали для получения жизнеспособной чистой культуры протосколексов E.multiocularis по вышеописанной методике (стр. 4-6). Из полученной чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis готовили клеточную культуру с последующим культивированием и получением антигенов протосколексов (патент №2219551 - 2003. Бюл №35). Протективную эффективность полученного антигена протосколексов E.multiocularis проверили на 30 беспородных белых мышах.

Непосредственно перед проведением экспериментов на животных-моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы антигена протосколексов E.multilocularis (по белку) в объемном выражении. Разовая иммунизирующая доза для мышей составляла 0,2 мл (80 мкг белка). Протективные свойства антигена изучили на животных-моделях при 2-кратном подкожном введении с интервалом 10 дней и последующем проверочном заражении иммунизированных и контрольных животных инвазивным материалом E.multitocularis через 14 дней после последней иммунизации. Исследования провели на экспериментальных 30 белых беспородных мышах, массой 20,0 г, распределенных на 2 равноценные группы по 15 мышей в каждой. У мышей, иммунизированных антигеном протосколексов E.multitocularis защитный эффект составил 80%, у трех мышей (20%) из 15 были обнаружены в печени цисты паразита без зародышевых элементов. У всех контрольных мышей были обнаружены многочисленные ларвоцисты во всех внутренних органах и в брюшной полости размером до 1,2 см в диаметре. В большинстве ларвоцист паразита регистрировали сформировавшиеся протосколексы.

Таким образом, антиген, полученный из выделенной чистой культуры протосколексов E.multilocularis, является эффективным стимулятором защитных иммунных механизмов.

Положительный эффект изобретения Ключевым моментом исследований по поиску оптимальных способов выделения очищенной и жизнеспособной культуры протосколексов в больших объемах является повышение качества получаемой культуры протосколексов. В настоящий момент метод выделения через мельничный газ предусматривает применение ручного труда на всех этапах выделения культуры, особенно на этапе выделения протосколексов путем многократного перетирания и промывания биомассы ларвоцист. При данном способе в культуру могут выделяться как жизнеспособные, так и нежизнеспособные протосколексы, а также иные элементы, такие как обрывки капсул, клетки ларвоцист, гной переродившихся цист, ткани животного и прочее. Кроме того, при таком способе получения выход остатка биомассы, содержащего в себе жизнеспособные протосколексы достаточно велик, так как цистная ткань зачастую имеет хрящеподобное строение и с трудом подвергается ручной и механической деструкции. Помимо прочего описанный выше процесс является трудоемким и времязатратным.

Предложенный способ выделения протосколексов E.multiocularis путем переваривания в ИЖС обеспечивает отбор только жизнеспособных протосколексов и позволяет произвести предварительную очистку культуры от посторонних включений биологического происхождения по сравнению с ручным методом выделения. Также снижаются потери ценного биоматериала (протосколексы E.multiocularis) в связи с увеличением безотходности производства. Помимо прочего заметно снижаются затраты времени на получение жизнеспособной культуры протосколексов (до 1,5 часов). Способ прост в исполнении, не требует дополнительного оборудования и больших материальных затрат, позволяет увеличить выход чистых жизнеспособных протосколексов E.multitocularis до 95-98%.

Предложенный нами способ не является очевидным, так как никто в мире до нас никогда не получал культуру протосколексов E.multiocularis путем переваривания ларвоцист в искусственном желудочном соке. Применение аппарата ускоряет процесс и обеспечивает выделение исключительно живых протосколексов.

Информация, принятая во внимание:

1. Бережко В.К., Кленова И.Ф., Сивкова Т.Н., Коваленко Ф.П., Бессонов А.С., Написанова Л.А., Гламаздин И.Г. Патент "Способ получения диагностического антигена цестод", 20.12.2003. №2219551 - 2003. Бюл №35.

2. Коваленко Ф.П., Джаброва В.И, Баллад Н.Е., Збарский А.И., Буланова Т.Е. Способ хранения ларвального альвеококка. Номер патента 1839182, опубликовано: 30.12.1993.

3. Маркин А.В. Эпидемиологическая ситуация по гельминтозам в России (1986-1995) // Матер. Докл. Науч. конф. Всеросс. О-ва гельминтол. «Теория Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 1999 – с. 152-154.

4. Мусаев Г.Х. Эпидемиологические аспекты развития эхинококкоза // Матер. Докл. Науч. конф. Всеросс. О-ва гельминтол. «Теория Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 1999 – с. 170-171.

5. Письмо от 20.06.2016 №01/7782-16-27 "О заболеваемости эхинококкозом и альвеококкозом в Российской Федерации" [Электронный ресурс]: http: //www.rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/cca/ekhinokokkoz.pdf

6. Kovalenko F., Darchenkova N., Legonkov Y., Musaev G., Gudovsky L., Parshin V., et al. Hydatid diseases (cystic and alveolar) in Russia (1983-1997). Acta Parasitol. 2000; 45: 241-2.