Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования ятрогенного повреждения желчевыводящих протоков на экспериментальном животном

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования ятрогенного повреждения желчевыводящих протоков на свиньях. Выбор животных для экспериментального исследования определялся следующими факторами: 1) свиньи являются стандартным объектом для моделирования различного рода повреждений в биомедицинских исследованиях; 2) они обладают сопоставимой с человеком массой тела, сходными по строению и функционированию сердечнососудистой, дыхательной и пищеварительной системами, системой гемостаза [Adams D., McKinley М., 2009].

При ятрогенном повреждении желчевыводящих протоков (ЯПЖП) в зависимости от механизма повреждения (механическом, энергетическом) образуются микроскопические изменения стенки протока в области повреждения, которые представляют большой исследовательский интерес и играют важную роль в процессе выбора реконструктивно-восстановительных операций. Однако оценить распространенность этих изменений во время операции не представляется возможным, так как специальное нанесение ЯПЖП на человеке с целью исследования недопустимо, а забор биологического материала у человека, в данном случае проксимальной и дистальной культи пересеченного желчевыводящего протока, для проведения исследования невозможно по этическим соображениям.

Известен способ моделирования ближней-инфракрасной холангиографии на желчных протоках мышей, включающий исследование функции экскреции желчи при помощи липофильного ультрафиолетового флуоресцентного агента, который вводили внутривенно группе контрольных мышей в следующих условиях: 1) хронической обструкции желчных путей; 2) острой обструкции желчных путей; 3) перфорации желчных протоков и 4) холедо-холитиаз [Figueiredo J. et al., 2010]. Данная модель позволяет оценить экскрецию конкретного флуоресцентного агента и проходимость желчевыводящих протоков, в том числе и при их повреждении.

Недостатком данной модели является то, что оно не позволяет осуществлять исследования на желчевыводящих протоках морфологического характера, влияющего на выбор варианта хирургического вмешательства, направленного на его восстановление или реконструкция и носит только лишь диагностический характер.

Известен способ моделирования острого панкреатита у белой крысы, включающий блокирование выводных протоков поджелудочной железы путем установки катетера внутрь общего желчного протока через разрез его стенки; наложение 3 лигатур поверх катетера с обеих сторон от разреза протока и перед местом разветвления общего желчного протока на долевые печеночные; стимуляцию секреции поджелудочной железы подкожной инъекцией прозерина и внутрижелудочным введением смеси жирного мясного бульона с этиловым спиртом; определение в сыворотке крови протеолитических ферментов поджелудочной железы; изучение морфологических изменений в поджелудочной железе (заявка на изобретение РФ №99116 667, G09B 23/28, опубл. 10.05.2001).

Недостатком данного способа является то, что он проводился на маленьких биологических объектах, для достижения сопоставимого экспериментального исследования необходимо использование крупных биообъектов.

Известен способ моделирования острого деструктивного панкреатита у крыс, который позволяет разработать модель, наиболее оптимально соответствующую патогенетическим механизмам развития острого деструктивного панкреатита у человека. Вводят в общий желчный проток соли желчных кислот, при этом в него 0,3 мл буферного раствора, содержащего 0,3 г трис-гидроксиметил-аминометана и 0,6 г дезоксихолата натрия в 100 мл с pH 8,8, со скоростью потока 0,07 мл в минуту и регулируют площадь панкреонекроза наложением лигатур выше или ниже места впадения дополнительного протока поджелудочной железы (патент РФ №2236709, G09B 23/28, опубл. 20.05.2004).

Недостатком данного способа является то, что для изучения патогенеза острого деструктивного панкреатита необходимо выполнение хронического эксперимента позволяющего оценить морфологические изменения в паренхиме поджелудочной железы в течение нескольких фаз течения панкреатита.

Известен способ моделирования острого гнойного холангита у экспериментальных животных, в котором с целью получения технического результата в виде оптимизации модели острого гнойного холангита и максимального приближения к клиническому течению заболевания проводится лапаротомия, общий желчный проток берут на две держалки, проксимальная при этом выполняет функцию лигатуры, и завязывают ее на игле выше места пункции общего желчного протока сразу после введения в него штамма №195 гемолитической E.Coli в концентрации 1⋅10⁵ КОЕ в 1 мл физиологического раствора в дозе 0,2 мл/кг массы с последующим ушиванием брюшной полости (патент РФ №2232430, G09B 23/28, опубл. 10.07.2004).

Недостатком данного способа является то, что согласно источникам литературы острый холангит возникает при концентрации E.Coli в концентрации 1⋅10⁸ КОЕ, вводимый в данном случае концентрат мог быть недостаточным для моделирования максимально приближенного к клиническому течению острого холангита.

Предлагаемая нами модель ЯПЖП на свиньях является оригинальной и предназначена для создания травмы желчевыводящих путей с разным механизмом воздействия на протоки (механически и при помощи энергии), сопоставимой с ЯПЖП у человека при выполнении лапароскопической холецистэктомии (ЛХЭ). Реализация разработанной модели ЯПЖП позволяет создавать более точные сопоставимые с человеком травмы желчевыводящих путей и проводить связанные с ними экспериментальные исследования, которые могут быть направленны на реконструкцию и/или восстановление поврежденного протока. Применение лапароскопии позволяет минимизировать травму и величину кровопотери в отличие от открытой операции, позволяет воспроизвести ЯПЖП аналогично с повреждениями желчных протоков при ЛХЭ у человека.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе моделирования ЯПЖП на крупном экспериментальном животном - свинье, включающем седацию экспериментального животного, фиксацию опытного животного на лабораторном столе в положении «на спине» с разведенными в стороны и фиксированными конечностями, проведение анестезии и инфузионной терапии, формируют карбоксиперитонеум иглой Вереша над пупком с парциальным давлением углекислого газа 14 мм рт.ст. в условиях общей комбинированной анестезии с интубацией трахеи и искусственной вентиляцией легких (ИВЛ), вводят 4 троакара, для манипуляторов, а именно над пупком вводят троакар диаметром 10 мм, под мечевидным отростком - 2 троакара диаметром 5 мм на расстоянии 3 см друг от друга, а в правой подреберной области - троакар диаметром 5 мм, затем при помощи мягкого зажима и диссектора частично выделяют холедох из печеночно-двенадцатиперстной связки в месте впадения пузырного протока в общий печеночный проток, а через отдельный прокол передней брюшной стенки под мечевидным отростком диаметром 10 мм вводят клипатор диаметром 10 мм, клипируют холедох, с фиксацией 2-х клипс проксимальнее от места впадения пузырного протока и 1-й клипсы дистальнее; затем общий желчный проток (ОЖП) полностью пересекают ниже места впадения в пузырный проток, между 2-мя проксимальными и 1-й дистальной клипсой, при этом при механическом повреждении ОЖП пересекают при помощи эндоскопических ножниц, а при термическом повреждении - при помощи L-образного электрода для диссекции, под воздействием монополярного диатермического генератора, установленного в режиме диссекции в заданной силе тока 70А в течение всех диатермических воздействий.

Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показано фото экспериментального животного (свиньи), фиксированного на операционном столе: произведена интубация трахеи для выполнения искусственной вентиляции легких аппаратом «MinorVet», фиг. 2, на которой показаны места введения троакаров для эндовидеохирургических инструментов и моделирования ЯПЖП: а - троакар 10 мм; б, в, г - троакары 5 мм, и фиг. 3, на которой представлена схема области нанесения ЯПЖП в эксперименте: а - желчный пузырь; б - 2 клипсы в области ОПП; в - 1 клипса в области ОЖП; г - место пересечения.

Способ моделирования ЯПЖП на экспериментальном животном включает седацию экспериментального животного, фиксацию опытного животного на лабораторном столе в положении «на спине» с разведенными в стороны и фиксированными конечностями, проведение анестезии и инфузионной терапии путем установки венозного катетера через большую ушную вену. После проведения этих предварительных процедур формируют карбоксиперитонеум иглой Вереша над пупком с парциальным давлением углекислого газа 14 мм рт.ст. в условиях общей комбинированной анестезии с интубацией трахеи и искусственной вентиляцией легких (фиг. 1). Для нанесения ЯПЖП мы использовали эндовидеохирургическую аппаратуру ЭФА-медика, позволяющую произвести доступ к общему желчному протоку через отдельные проколы на передней брюшной стенке от 5 мм до 10 мм. Вводят 4 троакара, для манипуляторов, а именно над пупком вводят троакар диаметром 10 мм, под мечевидным отростком - 2 троакара диаметром 5 мм на расстоянии 3 см друг от друга, а в правой подреберной области - троакар диаметром 5 мм (фиг. 2). Затем при помощи мягкого зажима и диссектора частично выделяют холедох из печеночно-двенадцатиперстной связки в месте впадения пузырного протока в общий печеночный проток, а через отдельный прокол передней брюшной стенки под мечевидным отростком диаметром 10 мм вводят клипатор диаметром 10 мм, клипируют холедох, с фиксацией 2-х клипс проксимальнее от места впадения пузырного протока и 1-й клипсы дистальнее (фиг. 3). Затем общий желчный проток (ОЖП) полностью пересекают ниже места впадения в пузырный проток, между 2-мя проксимальными и 1-й дистальной клипсой, при этом при механическом повреждении ОЖП пересекают при помощи эндоскопических ножниц, а при термическом повреждении - при помощи L-образного электрода для диссекции, под воздействием монополярного диатермического генератора, установленного в режиме диссекции в заданной силе тока 70А в течение всех диатермических воздействий. Эндотрахеальный наркоз и ИВЛ проводилось в течение 4 часов после завершения операции, а затем выводили из эксперимента с проведением секционного исследования.

Проведение острого эксперимента малоинвазивным способом позволило воспроизвести точную модель ЯПЖП. Техническим результатом изобретения явилась возможность проведения исследований на поврежденном протоке, путем его полного забора. Так после реализации изобретенной оригинальной модели ЯПЖП нами установлена возможность гистологического морфометрического исследования поврежденного протока, как проксимальной так дистальной культи протока, что недопустимо выполнять у людей при возникновении ЯПЖП (фиг. 4). Проведенное нами морфометрическое исследование позволило определить степень распространенности повреждения в зависимости от механизма воздействия на проток, несмотря на отсутствие макроскопических изменений в нем. Так, при механическом воздействии необратимые изменения в стенке протока возникли на расстоянии 3 мм от места диссекции, а при термическом повреждении на 7 мм, как в проксимальном, так и в дистальном направлениях [Майстренко Н.А. и соавт., 2016; Maystrenko N. et al., 2016]. Данные микроскопические изменения в стенке поврежденного протока должны учитываться при выполнении реконструктивно-восстановительных оперативных вмешательствах на протоках, а именно необходимо выполнять резекцию культи протока на 3 мм при механическом воздействии и на 7 мм при энергетическом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Майстренко, Н.А. Острое повреждение желчевыводящих протоков / Н.А. Майстренко, П.Н. Ромащенко, А.К. Алиев, С.А. Сибирев // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2016. - №1(53). - С. 124-130.

2. Adams, D. The Sheep / D. Adams, M. McKinley // [Электронный ресурс] ANZCCART Fact Sheet A9. - 2009. - URL: http://www.adelaide.edu.au.

3. Figueiredo, J. Intraoperative near-infrared fluorescent cholangiography (NIRFC) in mouse models of bile duct injury / J. Figueiredo, S. Cory, N. Matthias, R. Weissleder // World J. Surg. - 2010. Vol. №34. - P. 336-343.

4. Maystrenko, N. Acute injury of bile ducts / N. Maystrenko, P. Romashchenko, A. Aliev [et al.] // Research Journal of Medical Sciences - 2016. - Vol. №10 (1). - P. 740-744.