×
09.08.2018
218.016.7a16

Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии, медицине и терапии наследственных заболеваний. Предложена генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека. Указанная конструкция содержит промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3’-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину. Изобретение может быть использовано для элиминирования митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями. 1 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с направляющей РНК, быть использовано для элиминирования патогенных мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с различными наследственными митохондриальными патологиями.

Известен «Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии» (патент РФ №2375019, A61F 9/007, A61K 35/28, А61Р 27/02, 2003 г.), обеспечивающий улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций на небольшом временном промежутке, поскольку не направлен на коррекцию наследственного материала митохондрий.

Известно изобретение «Митохондриальные таргетные антиоксиданты» (Mitochondrially targeted antioxidants) (патент США № US 6331532, C07F 9/54, C07F 9/572, C07F 9/655, A61K 31/665, A61K 31/66, 1998 г.), которое является технологией импорта функциональных молекул в митохондрии, с использованием липофильных агентов с иммобилизованными молекулами антиоксидантов, но не дает возможности осуществлять редактирование патогенных мутаций в митохондриальной ДНК.

Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент Канады № CA 2678572 2008 г. A61K48/00D2, C12N15/864A, C12N15/90B4). Недостатками данной технологии является то, что она не подразумевает доставку в митохондрии белков, поэтому не может быть использована для импорта нуклеазы AsCpf1 в митохондрии, следовательно, не подходит для работы с системой CRISPR/Cpf1.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно использование генетических конструкций на базе системы редактирования генома CRISPR/Cpf1 для элиминирования патогенных мутаций мтДНК путем доставки нуклеазы AsCpf1 в митохондрии; генетические конструкции отличаются модификацией последовательности кодирующей AsCpf1, обеспечивающей доставку данной нуклеазы в митохондрии.

Отличительным признаком изобретения является модификация нуклеазы AsCpf1, обеспечивающая ее доставку в митохондрии для обеспечения универсального механизма для специфической элиминации дефектной мтДНК, несущей ту или иную мутацию. Новизну представляют нуклеотидные последовательности конструкции, которая кодирует модифицированный белок AsCpf1.

Задачей заявляемого изобретения является элиминирование митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями.

Поставленная задача решается тем, что генетическая конструкция заявляемого изобретения, после попадания в цитоплазму клеток, обеспечивает экспрессию кодируемых ею молекул нуклеазы AsCpf1, которые, используя собственный аппарат клетки, транспортируются в митохондрии, где обеспечивают элиминирование мутантных молекул мтДНК путем распознавания специфического участка последовательности посредством взаимодействия со специфической направляющей РНК и последующей рестрикцией обеих цепей мтДНК. Поскольку в митохондриях отсутствуют системы репарации двухцепочечных разрывов, такие «разрезанные» мтДНК элиминируются экзонуклеазами. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не имеющих мутации.

Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации мутантной мтДНК и способа ее доставки в органеллы.

Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cpf1. Нуклеаза AsCpf1 взаимодействует с особыми направляющими молекулами РНК, образуя комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональный домен AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК.

Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека, представляет собой плазмидные векторы, разработанные на базе векторов pUC19 и pTurboGFP-mito. Плазмидный вектор обеспечивает возможность трансформации компетентных клеток E.coli с последующей наработкой большого количества копий. Позволяют отбирать трансформированные колонии на селективной среде, содержащей антибиотик. Обеспечивают экспрессию нуклеазы AsCpf1 в клетках млекопитающих и человека, а также доставку продуктов трансляции в митохондрии. Проникая в митохондрии, нуклеаза AsCpf1 может быть использована для специфической элиминации мтДНК, содержащей любую из описанных мутаций благодаря взаимодействию с определенной направляющей РНК.

Белок AsCpf1 обладает нуклеазной активностью и имеет два активных центра, каждый их которых участвует в расщеплении одной из цепей двухцепочечной ДНК. Нуклеаза AsCpf1 связывается с направляющей РНК, образуя комплекс. Данный комплекс сканирует молекулу ДНК и в случае обнаружения гомологичной последовательности формирует дуплекс с участком направляющей РНК. После образования дуплекса нуклеаза AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК в определенной структуре дуплекса, названной РАМ (protospacer adjacent motif). Ближайший аналог нуклеазы семейства Cpf1 является нуклеаза Cas9. Последняя, однако, обладает большим размером, в силу чего хуже импортируется в митохондрии.

Генетическая конструкция pMitoAsCpf1 содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3×FLAG, последовательность, кодирующую модифицированную нуклеазу AsCpf1, Т2А, ген TurboGFP, 3' UTR гена SOD2.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Карта генетической конструкции pMitoAsCpf1 была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки использовали фрагменты плазмид pTurboGFP-mito (# FP517, Evrogen), pUC19 и pY010 AsCpf1, а также синтезированные по заказу двухцепочечные фрагменты ДНК - gBloks (IDT, США). Амплификацию фрагментов ДНК проводили при помощи полимеразы PfuTurbo Сх (Agilent Technologies, США) на амплификаторе С1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия), очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 («Биоссет») с применением реагентов компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с использованием ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили путем сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы производителя.

На фиг. 1 представлена карта генетической конструкции pMitoAsCpf1, кодирующего нуклеазу AsCpf1, импортируемую в митохондрию.

Оценки эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась на культуре клеток.

Клетки выращивали на покровных стеклах 15×15 мм в 12-луночных планшетах. Через 48 ч после трансфекции генетической конструкцией митохондрии окрашивали 150 нМ красителем MitoTracker® Red CMXRos (Life Technologies, США) в течение 30 мин. при 37°C согласно инструкции фирмы-производителя. Далее клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на PBS, промывали 2 раза по 5 мин раствором PBS, обрабатывали клетки 0,2% Triton Х-100 на PBS в течение 10 мин и промывали клетки 2 раза по 5 мин PBS. Для блокирования неспецифического связывания антител клетки инкубировали в течение 30 мин с 10% раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере при 37°C. Инкубирование с первичными антителами против эпитопа 3×FLAG (Sigma, США) в разведении 1:500 в 3% BSA проводили при 37°C в течение 2 ч. После трехкратной промывки раствором PBS в течение 5 мин добавляли вторичные антитела (Life Technologies, США), конъюгированные с Alexa Fluor® 488 в разведении 1:500 в 3% BSA на PBS, и инкубировали при 37°C в течение 45 мин. Клетки промывали 3 раза по 5 мин буфером PBS, ядра окрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS в течение 5 мин, промывали два раза по 5 мин в PBS и под покровное стекло наносили по 10 мкл раствора антифейда (90% глицерин, 0,1 М Tris-HCl и 23,3 мг/мл DABCO (1,4диазабисцикло(2,2,2)октан). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Использование заявляемых генетических конструкций позволяет осуществлять терапию наследственных митохондриальных патологий.

Генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, представленная на фиг. 1 и содержащая промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3'-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину.
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 48 items.
25.08.2017
№217.015.c59d

Комплекс микросейсмического контроля разработки континентальных и шельфовых месторождений углеводородов на основе площадных систем наблюдения и суперкомпьютерных методов обработки информации

Изобретение относится к геофизическим методам исследования процессов разработки месторождений углеводородов, в частности к комплексам микросейсмического контроля разработки континентальных и шельфовых месторождений углеводородов, содержащим, по крайней мере, один телеметрический сейсмический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002618485
Дата охранного документа: 03.05.2017
25.08.2017
№217.015.ca3c

Способ определения концентрации адсорбатов наночастиц серебра на поверхности нанопористого кремнезема

Изобретение относится к области нанотехнологий, а также может быть использовано в биологии, медицине, гетерогенном катализе. Способ определения концентрации адсорбатов наночастиц (НЧ) серебра на поверхности нанопористого кремнезема включает приготовление раствора исследуемого вещества,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002620169
Дата охранного документа: 23.05.2017
19.01.2018
№218.016.0286

Способ защиты стали от коррозии и наводороживания органическими соединениями в средах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии

Изобретение относится к области защиты металлов от коррозии, наводороживания и развития сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) и может быть использовано в водно-солевых средах, содержащих СРБ. Способ включает введение в коррозионную среду ингибитора-бактерицида, при этом в качестве...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630149
Дата охранного документа: 05.09.2017
20.01.2018
№218.016.1004

Способ генетического контроля экзоцитоза на основе генетических конструкций для трансфекции клеток астроглии

Изобретение относится к области молекулярной биологии и касается генетической конструкции для осуществления способа генетического контроля экзоцитоза. Представленная конструкция имеет последовательность SEQ ID NO:4 и получена с использованием лентивирусного вектора на основе ВИЧ-1...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633691
Дата охранного документа: 16.10.2017
20.01.2018
№218.016.1062

Способ молекулярной диагностики митохондриальных патологий на основе технологии пиросеквенирования

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера. Всего разработаны четыре системы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633752
Дата охранного документа: 17.10.2017
13.02.2018
№218.016.24cd

Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, путем определения концентраций аденозинтрифосфата в митохондриях

Изобретение относится к медицине и касается флуоресцентного способа прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, путем определения концентраций аденозинтрифосфата в митохондриях, при котором производят забор крови до и после химиотерапии, выделяют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642589
Дата охранного документа: 25.01.2018
04.04.2018
№218.016.36b8

Экспериментальная установка (стенд) для изучения многофакторной зависимости коэффициента демпфирования сваи при взаимодействии с грунтом

Изобретение относится к области вибрационной техники, а именно к конструкциям свайных фундаментов зданий и сооружений гражданского и промышленного назначения. Экспериментальная установка состоит из лотка, грунтового массива и моделируемой сваи. Вибрируемый на вибростенде металлический лоток с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002646540
Дата охранного документа: 05.03.2018
10.05.2018
№218.016.3c12

Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом

Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физики, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002647834
Дата охранного документа: 19.03.2018
09.06.2018
№218.016.5c34

Способ ранней генетической диагностики риска развития сахарного диабета 2 типа

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике, и предназначено для ранней генетической диагностики риска развития сахарного диабета (СД) 2 типа. Осуществляют экстракцию ДНК из периферической крови с последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002655635
Дата охранного документа: 29.05.2018
20.06.2018
№218.016.63d7

Устройство и способ для дистанционной беспроводной диагностики функционального состояния сердечно-сосудистой системы человека на основе двигательной активности и фотоплетизмографии

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к медицинской технике, и может быть использована в функциональной диагностике состояния сердечно-сосудистой системы амбулаторно. Устройство для дистанционной беспроводной диагностики функционального состояния сердечно-сосудистой системы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002657966
Дата охранного документа: 18.06.2018
Showing 1-7 of 7 items.
10.08.2013
№216.012.5bfc

Способ лечения онкологических заболеваний

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для комплексного лечения пациентов с онкологическими заболеваниями. Для этого в организм пациента вводят препарат цитостатической группы и препарат фрагментированной двуцепочечной ДНК с фрагментами, имеющими...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002489169
Дата охранного документа: 10.08.2013
20.08.2013
№216.012.5f4c

Способ лечения онкологических заболеваний

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при комплексном лечении пациентов больных раком молочной железы II-IV. Для этого после однократного в рамках одного цикла химиотерапии пациенту вводят цитостатики: циклофосфан (500 мг/м) и доксорубицин (50 мг/м)...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002490028
Дата охранного документа: 20.08.2013
20.11.2013
№216.012.8179

Способ стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов. Предложен способ стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, основанный на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002498821
Дата охранного документа: 20.11.2013
20.01.2018
№218.016.1062

Способ молекулярной диагностики митохондриальных патологий на основе технологии пиросеквенирования

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК. Проводят реакцию просеквенирования с системой, состоящей из прямого праймера, обратного праймера, меченного биотином, и секвенирующего праймера. Всего разработаны четыре системы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633752
Дата охранного документа: 17.10.2017
20.01.2018
№218.016.12ec

Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для экспрессии нуклеазы Cas9 в клетках человека. Получают генетическую конструкцию pMitoCas9 с SEQ ID NО:1 на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, которая кодирует нуклеазу cas9, специфически импортируемую в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634395
Дата охранного документа: 26.10.2017
22.12.2019
№219.017.f0e0

Генетические конструкции, кодирующие направляемые в митохондрии клеток человека нуклеазы cas9-be4-gam и cas9-abe 7.10

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может быть использовано для редактирования точечных патогенных мутаций, ассоциированных с наследственными митохондриальными патологиями. Генетические конструкции pMitoCas9-BE4-Gam и pMitoCas9-ABE7.10,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002709739
Дата охранного документа: 19.12.2019
30.03.2020
№220.018.11c7

Модификации структуры направляющей нуклеазу spcas9 молекулы рнк для обеспечения импорта в митохондрии клеток человека

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена импортируемая в митохондрии гидовая РНК с субдоменами транспортной РНК лизина HD и HF. Каждая из представленных направляющих РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD) взаимодействует с человеческой митохондриальной тРНК-лизил синтазой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002717977
Дата охранного документа: 27.03.2020
+ добавить свой РИД