СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МАКРОАНГИОПАТИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии и хирургии, и может быть использовано для прогнозирования развития макроангиопатий нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет (СД) 2-го типа - хроническое, прогрессирующее заболевание, течение которого сопровождается развитием макроангиопатий нижних конечностей у 30% больных [1, 3], с последующим образованием трофических язв на голени и стопе, что в половине случаев приводит к ампутации одной или обеих конечностей [8].

Известен способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа, при котором осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α, и при выявлении аллеля -308A TNFα прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа [6].

К недостаткам данного изобретения можно отнести то, что он недостаточно точен, так как TNFα - многофункциональный цитокин, обеспечивающий широкий спектр биологических процессов при различных патологических состояниях. Полиморфизм 308G/A гена фактора некроза опухоли α и выявление аллеля -308A TNFα может встречаться при других патологических процессах организма, таких как гипертоническая болезнь и синдром раздраженного кишечника [2, 5].

Прототипом для данного изобретения служит способ оценки течения раневого процесса при синдроме диабетической стопы [7], в основе которого лежит определение в сыворотке крови больных липопротеинов низкой плотности, малоновогодиальдегида, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Рассчитывают их интегральные показатели как отношение содержания указанных продуктов свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантных ферментов у больных к среднему значению их содержания у здоровых лиц. Вычисляют прогностический коэффициент путем отношения произведений интегральных показателей липопротеинов и малоновогодиальдегида к показателям глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы и при значении прогностического коэффициента равном или выше 3,0 прогнозируют неблагоприятное течение раневого процесса.

Предложенный способ длителен по времени проведения, трудоемкий, так как для его применения необходимо специальное оборудование и большое количество реактивов. Кроме того, эти лабораторные показатели могут быть результатом окислительных процессов при других патологических состояниях организма, что может отразится на суточной динамике коэффициента соответственно суточным и циркадным ритмам, вводя в заблуждение врача.

К недостаткам способа можно отнести то, что в данном способе рассматриваются лишь активаторы и ингибиторы свободнорадикального процесса, развивающиеся при многочисленных патофизиологических реакциях, т.е. прогнозирование в вышеуказанном индексе проводится в рамках одной системы, что снижает достоверность прогноза.

Для повышения точности прогнозирования развития макроангиопатий нижних конечностей у больных с сахарным диабетом 2 типа в крови определяют содержание низкомолекулярного α-кетоальдегида метилглиоксаля и свободного глутатиона. Рассчитывают их относительные величины по отношению к средним значениям у здоровых лиц и вычисляют прогностический коэффициент (К) по формуле , где Р₁ - соотношение относительного содержания метилглиоксаля у больных и здоровых лиц, Р₂ - соотношение относительного содержания свободного глутатиона у больных и здоровых лиц и при значении коэффициента равном или выше 2,8 прогнозируют развитие макроангиопатий нижних конечностей.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь забирают у больных сахарным диабетом 2 типа в вакутайнеры с ЭДТА путем пункции локтевой вены с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. После проведения депротеинизации (70 мкл НСlO₄ на 1 мл плазмы) интенсивно перемешивают на миксере до получения гомогенной массы, центрифугируют 2 мин при 10.000 rpm. Супернатант используют для дериватизации. К 200 мклсупернатанта добавляют 50 мклофенилендиамина и помещают в термостат на 10 мин при 50°С. После охлаждения дериваты биопробы добавляют 1.5 мл эфира и перемешивают и упаривают досуха в термостате при 50°С. Сухой остаток биопробы растворяют в 100 мкл воды и 25 мкл вводят в петлю инжектора (эквивалент 0.05 мл плазмы). Разделение ведут на С18 колонках, УФ детекцию при 310 нм. Полное хроматографическое разделение в пределах 9 мин. Предел количественного обнаружения (LOQ) составил 0.05 нг на инъекцию при соотношении сигнал/шум=10.

После этого определяют уровень свободного глутатиона. Кровь отбирают в вакутайнеры с ЭДТА, центрифугируют и удаляют плазму. Эритроциты отмывают 3-4 объемами физиологического раствора и центрифугируют 2 мин при 3000 rpm. Далее отбирают 40 мкл эритроцитарной массы и добавляют 360 мкл воды, перемешивают и дериватизируют. Дериватизацию проводят путем добавления к гемолизату 70 мкл 1,4-дитиоэритритиола и 140 мкл 0,25М фосфатного буфера с рН 8,0. Смесь помещают в термостат на 15 мин при 60°С. Затем добавляют 40 мкл внутреннего стандарта (L-пеницилламин, 100 нг/мкл), 50 мкл реагента Эллмана, перемешивают и выдерживают 10 мин. После этого добавляют 25 мкл хлорной кислоты, перемешивают интенсивным встряхиванием и центрифугируют 2 мин при 10,000 об/мин. Далее отбирают 100 мкл супернатанта и 8,8 мкл вводят в петлю инжектора (содержит 100 нг IS и эквивалентно 0,00044 мл эритроцитарной массы) и хроматографируют. Для проведения хроматографии использовали: флюориметрический детектор RF-10AXL (Shimadzu, Япония), спектрофотометрический детектор Shimadzu SPD-М20, насос высокого давления LC-20AT Prominence (Shimadzu, Japan), ручной инжектор 7725i Rheodyne (USA) с петлей на 100 мкл, компьютерную хроматографическую программу "Мультихром" версия 3.0 (Амперсанд, Россия) [3, 4].

На основании полученных данных рассчитывают следующие показатели:

1) относительное содержание метилглиоксаля - Р₁ по формуле: ,

2) относительное содержание свободного глутатиона - Р₂ по формуле ,

где i - содержание метилглиоксаля и свободного глутатиона у больных сахарным диабетом 2 типа;

n - среднее значение содержания метилглиоксаля и свободного глутатиона у здоровых лиц.

Для расчета показателей используют параметры содержания свободного глутатиона и метилглиоксаля у здоровых людей:

GSH free=752 мкг/мл;

MGo=36 нг/мл.

После чего производят расчет прогностического коэффициента (К) путем отношения показателей относительного содержания метилглиоксаля (P₁) к относительному содержанию свободного глутатиона (Р₂), по формуле: , и при значении коэффициента меньше 2,8 прогнозируют благоприятное течение заболевания, а при значении коэффициента равном и выше 2,8 прогнозируют развитие макроангиопатий нижних конечностей.

Выбор критериев для прогнозирования основан на том, что на фоне сахарного диабета гликирование белков усиливается, что связано с повышением уровня глюкозы и производных сахаридов как в плазме крови, так и в поврежденных сосудах. Это приводит к образованию конечных продуктов гликирования (КПК), которые являются основными триггерами в патогенезе сосудистых осложнений [1]. Реактивные соединения дикарбонила, такие как глиоксаль (Go), метилглиоксаль (MGo) и 3-DG, служат предшественниками основных остатков КПГ в зонах развития сосудистых осложнений сахарного диабета. Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что интенсивность гликирования под действием метилглиоксаля нарастает при сахарном диабете. По-видимому, это обусловлено синтезом метилглиоксаля из триозофосфата, который накапливается в стенках сосудов вследствие гипергликемии. Активация полиольного пути метаболизма глюкозы приводит не только к генерации соединений дикарбонила, но и к снижению активности восстановленного глутатиона - основного антиоксиданта клетки. Свободный глутатион, способен деактивировать метилглиоксаль путем превращения его в лактат, данный процесс еще раз подтверждает общность оксидативного и карбонильного стрессов.

Способ прогнозирования развития макроангиопатий нижних конечностей у больных сахарным диабетом иллюстрируется следующими примерами.

1. Пример 1. Больной П., 59 лет, госпитализирован с диагнозом: Сахарный диабет 2 типа. Уровень гликированного гемоглобина HbAlc≤8%. Глюкоза крови натощак - 12 ммоль/л. При поступлении в стационар пациенту произведено исследование показателя кетоальдегида - метилглиоксаля (MGo) - 72,5 нг/мл, и свободного глутатиона - GSHfree - 443 мкг/мл.

У пациента К выше 2,8. Прогнозируют неблагоприятное течение заболевания с высоким риском развития макроангипатий нижних конечностей.

В процессе лечения на 5 сутки появилось чувство онемения по медиальной поверхности левой голени в нижней трети, гиперемия кожных покровов. В последующем через 2 суток в этой области образовалась трофическая язва размером 1,2×2,0 см, покрытая фибрином.

Заключительный диагноз: Основной: Сахарный диабет 2 тип. Достигнутый уровень HbAlс ≤7%. Макроангиопатия нижних конечностей. Осложнения: Трофическая язва левой голени, 1ст по Wagner.

Пример 2. Больная Н, 58 лет, госпитализирована с диагнозом: Сахарный диабет 2 типа. Целевой уровень гликированного гемоглобина HbAlc ≤7%. При поступлении в клинику пациентке произведено исследование исследуемых показателей в сыворотке крови: глюкоза крови - 9.4 ммоль/л, метилглиоксаль (MGo) - 68 нг/мл. Свободный глутатион - GSHfree=543 мкг/мл.

Так как К=3,0 (>2,8), прогнозирована высокая вероятность развития сосудистых осложнений нижних конечностей. С целью коррекции выявленных нарушений назначено внутривенное введение дезагрегантов. Несмотря на проводимое лечение, на девятые сутки появилось чувство онемения в пальцах обеих стоп, на тыле правой стопы появилась трофическая язва 0,5×1,2 см.

Заключительный диагноз. Сахарный диабет 2 тип. Достигнутый уровень HbAlc ≤7%. Осложнение: Синдром диабетической стопы. Трофическая язва правой стопы, 1ст по Wagner. Выписана на амбулаторное лечение. Подключены препараты с антиоксидантной активностью, гипербарическая оксигенация, местное лечение язвы антисептиками. На 24 сутки язва зажила вторичным натяжением. В эти сроки: глюкоза крови - 11.2 ммоль/л, метилглиоксаль (MGo) - 40 нг/мл, свободный глутатион - GSHfree=687 мкг/мл.

Пример 3. Больной К., 52 лет, госпитализирован с диагнозом: Сахарный диабет 2 типа. При поступлении пациенту произведено исследование показателя глюкозы крови, уровней метилглиоксаля и свободного глутатиона в сыворотке крови. Глюкоза крови - 6,9 ммоль/л, глиоксаль (MGo) - 39 нг/мл, свободный глутатион - GSHfree=669 мкг/ мл.

В процессе лечения и последующего наблюдения никаких воспалительных и ишемических расстройств со стороны нижних конечностей выявлено не было. Следовательно, исследование показателей метилглиоксаля и свободного глутатионав в сыворотке крови у больных сахарным диабетом 2 типа позволяет прогнозировать возможность развития сосудистых осложнений нижних конечностей на стадии доклинических проявлений и вносить необходимую коррекцию в план лечения.

Предложенный способ прогнозирования развития макроангиопатий нижних конечностей апробирован у 30 пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Таким образом, чувствительность предлагаемого способа прогнозирования составляет - 19/21×100=90,5%, точность - 8+19/30×100=89,0%, специфичность - 8/9×100=88,9.

Литература

1. Антонова К.В. Антиоксидантные эффекты Пробукола в комплексной терапии сахарного диабета 2-го типа / К.В. Антонова, Л.В. Недосугова, М.И. Балаболкин и др. // Проблемы эндокринологии.- 2008. - Т. 54, №4. - С. 7-10.

2. Иванова Е.Л. Полиморфизм генов цитокинов IL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFα и изменения микробного спектра кишечника у больных синдромом раздраженного кишечника Е.Л. Иванова, А.С. Сарсенбаева, Д.С. Сташкевич, Н.З. Жамалдинова // http://dkmsc.ru/genetika/item/42-polimorfizm-genov-tcitokinov-il-1ra-il-1b-il-4-tnfa-i-izmeneniia-mikrobnogo-spektra-kishechnika-u-bol-ny-kh-sindromom-razdrazhennogo-kishechnika.

3. Дутов А.А., Никитин Д.А., Шемякина Н.А. Простой ВЭЖХ метод анализа глиоксаля и метилглиоксаля в плазме // EuropeanJournalofAnalyticalandAppliedChemistry №1, 2017 С. 14-20.

4. Дутов А.А., Шемякина Н.А., Простой ВЭЖХ-анализ глутатиона в эритроцитах» - / Н.А. Шемякина, А.А. Дутов // Вопросы медицинской и фармацевтической химии №6. 2015 г. - С. 12-15.

5. Патент RU 2580310 G01N 33/48. Способ прогнозирования гипертонической болезни у индивидуумов, имеющих наследственную отягощенность. / Чурносов Михаил Иванович, Кривошей Ирина Васильевна, Алферов Петр Константинович, Полоников Алексей Валерьевич; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") - №2014151179/15, заявл. 17.12.2014, опубликовано 10.04.2016 Бюл. №10.

6. Патент RU 2507520 С1. Способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа / Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" - №: 2012155169/15, заявлено 18.12.2012, опубликовано 20.02.2014. Бюл. №5.

7. Патент RU 256601, МПК G01N 33/49. Способ оценки течения раневого процесса при синдроме диабетической стопы / Е.В. Намоконов, A.M. Мироманов, С.Т. Кохан; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Минздрава России - №2010150054/15, заявл. 06.12.2010 г. Опубликовано 20.07.2012.

8. Пащина С.Н. Клинические и гемолимфатические нарушения при гнойно-деструктивных процессах у больных с синдромом диабетической стопы / С.Н. Пащина // Автореф. … канд. мед. наук. - Новосибирск. - 2007. - 20 с.

9. Патент РФ 2423694, МПК G01N 33/48. Способ прогнозирования развития воспалительного процесса. / Мироманов A.M., Намоконов Е.А., Мироманова Н.А., Кохан С.Т., Давыдов C.O.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Минздрава России - №2009107401/15, заявл. 02.03.2009. Опубликовано 10.07.2011 г.