Способ диагностики эндометриоза у женщин с бесплодием

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики эндометриоза у женщин с бесплодием неясного генеза.

Актуальность предлагаемого способа определяется высокой частотой распространенности эндометриоза, который диагностируется у 5-10% всех женщин репродуктивного возраста (Biomarkers of endometriosis / A. Fassbender [et al.] // Fertility and Sterility. - 2013. - Vol. 99, №4. - P. 1135-1145). По данным разных авторов эндометриоз диагностируется у 25-45% пациенток с бесплодием неясного генеза, у которых были исключены другие виды бесплодия при обследовании супружеской пары (High prevalence of endometriosis in infertile women with normal ovulation and normospermic partners / C. Meuleman [et al.] // Fertil Steril. - 2009. - Vol. 92, №1. - P. 68-74). Разнообразие форм эндометриоза, который может проявляться в виде эндометриоидных очагов на тазовой брюшине, эндометриоидных кист яичников, глубокого инфильтративного эндометриоза, распространяющегося до кишечника и мочевого пузыря, определяет трудности его диагностики только на основании клинических симптомов (Biomarkers of endometriosis / A. Fassbender [et al.] // Fertility and Sterility. - 2013. - Vol. 99, №4. - P. 1135-1145). Согласно общепринятому мнению «золотым стандартом» диагностики эндометриоза является лапароскопия с гистологической верификацией удаленных эндометриоидных очагов (Whitehill K. 1., Yong P.J., Williams С. Clinical predictors of endometriosis in the infertility population: is there a better way to determine who needs a laparoscopy? // J Obstet Gynaecol Can. - 2012. - Vol. 34, №6. - P. 552-557). Однако лапароскопия является хирургической процедурой с хотя и низким, но значительным потенциальным риском для пациентки. Поэтому разработка системы высокоинформативных лабораторных предикторов эндометриоза в популяции инфертильных женщин с нормальными показателями УЗИ-исследования имеет большое практическое значение. Включение дополнительных способов диагностики эндометриоза в комплекс обследования женщин с бесплодием, при исключении других причин, позволит врачу еще на дооперационном этапе оценить, насколько высок риск эндометриоза у каждой конкретной пациентки, и, соответственно, определить, нуждается ли эта пациентка в проведении диагностической лапароскопии. Разработка дополнительных лабораторных способов диагностики эндометриоза особо актуальна для женщин позднего репродуктивного возраста, при пограничных показателях фолликулярного запаса и отсутствии выраженных клинических проявлений, т.к. потерянное время усугубляет течение болезни и приводит к развитию более тяжелых форм эндометриоза.

Ранее было показано, что у пациенток с распространенным эндометриозом сывороточная концентрация ММР-2 значительно повышена по сравнению с группой женщин с бесплодием, обусловленным трубным фактором и/или мужским бесплодием и эндометриозом 1-2 степени. (Increased circulating ММР-2 levels in infertile patients with moderate and severe pelvic endometriosis / H. Malvezzi [et al.] // Reprod Sci. - 2013. - Vol. 20, №5. - P. 557-562). Однако этот способ имеет ряд недостатков:

- способ предназначен для диагностики только эндометриоза 3-4 степени и не позволяет диагностировать «малые» формы эндометриоза;

- отсутствуют данные о точности диагноза.

Еще одним аналогом заявляемого способа является способ диагностики эндометриоза по определению содержания в сыворотке крови инфертильных женщин маркеров оксидативного стресса. У пациенток с эндометриозом сывороточный уровень реактивных форм кислорода выше, а супероксиддисмутазы и витамина Е - ниже, чем у женщин с трубным фактором бесплодия (The expression and role of oxidative stress markers in the serum and follicular fluid of patients with endometriosis / Liu F. [et al.] // Clin Exp Obstet Gynecol. - 2013. - Vol. 40, №3. - P. 372-376). Однако диагностика эндометриоза по данному способу также имеет ряд недостатков:

- одновременное определение 3-х показателей значительно увеличивает время, необходимое для проведения анализа;

- отсутствуют данные о точности диагноза.

Было также показано, что эндометриоз значительно чаще (в 89% случаев) встречается у тех субфертильных пациенток, кто отмечает мажущие кровянистые выделения до менструации в течение 2 дней и более по сравнению с женщинами без этого симптома (26%) (ОШ 16, 95% доверительный интервал, 3,9-65,4; р<0,01). При этом авторы указывают, что предменструальные выделения в течение 2 дней как минимум ассоциированы с более высокой стадией заболевания и красными эндометриоидными очагами (Premenstrual spotting of≥2 days is strongly associated with histologically confirmed endometriosis in women with infertility / R.J. Heitmann [et al.] // Am J Obstet Gynecol. - 2014. - Vol. 211, №4. - 358.e1-6). К недостаткам данного способа можно отнести:

- отсутствие данных о частоте встречаемости предменструальных кровянистых выделений при бесплодии, обусловленном трубным фактором;

- данный способ в большей степени предназначен для диагностики активных форм эндометриоза.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием неясного генеза на основании определения в крови относительного количества CD16+ моноцитов в моноцитарном гейте. При значении этого показателя равного 45% или менее диагностируют наружный генитальный эндометриоз с точностью 80,5%, чувствительностью - 81,0%, специфичностью - 80,0% (Пат. 2291439 Российская Федерация, МПК G01N 33/577. Способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием / Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Анциферова Ю.С., Полумисков Д.М., Шишков Д.Н. // Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - 2007. - №1). Данный способ был выбран нами в качестве прототипа. Техническим результатом является расширение арсенала технических средств, а также повышение точности и чувствительности способа диагностики эндометриоза у женщин с бесплодием неясного генеза. Технический результат достигается тем, что в периферической крови пациенток с бесплодием определяют относительное содержание IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов и при значении этого показателя более 51,6% диагностируют эндометриоз с точностью 87,2%, чувствительностью 92,6% и специфичностью 80%).

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать эндометриоз у пациенток с бесплодием неясного по определению относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов.

Ранее было показано, что мембранная экспрессия IgD и его рецепторов в популяции CD19+ В-лимфоцитов значительно повышена при ревматоидном артрите (The Elevated Secreted Immunoglobulin D Enhanced the Activation of Peripheral Blood Mononuclear Cells in Rheumatoid Arthritis / Y. Wu [et al.] // PLoS One. - 2016. - Vol. 27, №11(1). - e0147788). У пациентов с венозной тромбоэмболией, характеризующихся персистенцией антифосфолипидных антител, в периферической крови отмечено повышенное содержание наивных CD27- В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране IgD молекулы (Lymphocyte Disturbances in Primary Antiphospholipid Syndrome and Application to Venous Thromboembolism Follow-Up / L. Simonin [et al.] // Clin Rev Allergy Immunol. - 2016. - Vol. 25. [Epub ahead of print]). У пациентов с псориазом было выявлено увеличение циркулирующего пула наивных В-лимфоцитов, имеющих фенотип CD19+IgD+CD27- (Increased circulating follicular helper T cells and activated В cells correlate with disease severity in patients with psoriasis / J. Niu [et al.] // J Eur Acad Dermatol Venereol. - 2015. - Vol. 29, №9. - P. 1791-1796). При хроническом грануломатозе, достаточно редком первичном иммунодефиците, уровень IgD+ клеток в популяции наивных CD27- лимфоцитов также был значительно повышен (Altered pattern of Naive and memory В cells and В1 cells in patients with chronic granulomatous disease / M. Mohsenzadegan [et al.] // Iran J Allergy Asthma Immunol. - 2014. - Vol. 13, №3. - P. 157-165).

Для диагностики эндометриоза у пациенток с бесплодием показатель относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов ранее не использовался.

Известно, что IgD молекулы, образующие вместе с IgM, CD79a и CD79b молекулами комплекс В-клеточного рецептора (BCR), обеспечивают проведение активирующего сигнала в В-лимфоциты. Максимальный уровень экспрессии IgD молекул отмечается в популяции зрелых наивных В-лимфоцитов, выходящих из костного мозга в циркуляцию, до их стимуляции антигеном. (Schroeder H.W., Cavacini L. Structure and Function of Immunoglobulins // J Allergy Clin Immunol. - 2010. - Vol. 125, №202. - S41-S52). Функция IgD молекул до сих пор до конца не ясна. Предполагают, что IgD-позитивные В-лимфоциты могут играть важную роль в развитии аутоиммунных реакций. Так, было установлено, что обработка В-лимфоцитов aнти - IgD-антителами, ведущая к деплеции IgD+ В-клеток, определяет значительное снижение продукции аутоантител (Anti-IgD antibody attenuates collagen-induced arthritis by selectively depleting mature B-cells and promoting immune tolerance / T.G. Nguyen [et al.] // J Autoimmun. - 2010. - Vol. 35, №1. - P. 86-97). Уровень IgD молекул в сыворотке резко повышен у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, а сам IgD может стимулировать пролиферацию мононуклеарных клеток крови, индуцировать продукцию ими провоспалительных цитокинов, активировать Т- и В-лимфоциты (The Elevated Secreted Immunoglobulin D Enhanced the Activation of Peripheral Blood Mononuclear Cells in Rheumatoid Arthritis / Wu Y. [et al.] // PLoS One. - 2016. - Vol. 27, №11(1). - e0147788). Также было показано, что популяция наивных IgD+CD27- В-лимфоцитов содержит аутореактивные клоны В-лимфоцитов, несущих преимущественно рецепторы, способные реагировать с аутоантигенами (Functional anergy in a subpopulation of naive В cells from healthy humans that express autoreactive immunoglobulin receptors / J.A. Duty [et al.] // J Exp Med. - 2009. - Vol. 206, №1. - P. 139-151). Принято считать, что в основе патогенеза эндометриоза лежат аутоиммунные нарушения, которые сопровождаются усиленной продукцией аутоантител различной специфичности (The possible role of genetic variants in autoimmune-related genes in the development of endometriosis / Bianco B. [et al.] // Human Immunology. - 2012. - Vol. 73. - P. 306-315). Выявленное нами повышенное содержание IgD+ в популяции CD19+ лимфоцитов с потенциальным аутоиммунным действием может способствовать развитию аутоиммунных нарушений при эндометриозе, которые оказывают негативное влияние на состояние репродуктивной функции пациенток с эндометриозом.

Способ осуществляется следующим образом.

1) К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл физраствора и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования (Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - Vol. 21, №97. - P. 77).

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии добавляют 5 мкл моноклональных антител анти-С019, конъюгированных с РеrСр, и 5 мкл анти-IgD антител, конъюгированных с FITC, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора Cell-Fix ™ (BD Biosciences, Belgium).

3) Определяют относительное содержание IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов на проточном цитофлюориметре. При значении этого показателя более 51,6% диагностируют эндометриоз.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью - 87,2% диагностировать эндометриоз у женщин с бесплодием.

Отличительными признаками способа являются:

установлен диагностический параметр относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов, при значении которого более 51,6% диагностируют эндометриоз.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1

Больная Ф. 32 года. Поступила в клинику с жалобами на бесплодие в браке, болезненные менструации.

Анамнез заболевания: отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции отмечает в течение 4 лет. По этому поводу обращалась в женскую консультацию по месту жительства. Супружеская пара обследована: по тестам функциональной диагностики цикл двухфазный, гормональный статус без отклонений от нормы, анализ крови на инфекции, передающиеся половым путем (полимеразная цепная реакция), - отрицательный. По УЗИ на 7 день цикла без отклонений от нормы. По данным гистеросальпингографии (ГСГ) - полость матки не изменена, просвет маточных труб имеет неизмененный вид, контрастируются на всем протяжении, контраст свободно поступает в брюшную полость. Мужу 35 лет, обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест положительный.

Менструации с 13 лет, установились в течение года, по 4-5 дней, через 28-30 дней, регулярные, умеренные, болезненные (принимает нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) в первый день), аномальных маточных кровотечений не отмечает. Половая жизнь с 18 лет. Беременностей не было, пролечена эктопия шейки матки.

Анамнез жизни: в детстве перенесла ветряную оспу, в зрелом возрасте - простудные заболевания, хронических болезней не отмечает. Операции, травмы отрицает, аллергических реакций не было. Наследственность не отягощена.

Гинекологический статус: наружные половые органы развиты правильно, оволосение по женскому типу, шейка матки конической формы, без дефектов, матка нормальных размеров, подвижная, безболезненная. Придатки не увеличены, безболезненны с обеих сторон. Пальпация крестцово-маточных связок болезненна, выделения слизистые.

Клинический диагноз: Бесплодие I неясного генеза. Подозрение на эндометриоз тазовой брюшины. Дисменорея.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов по заявляемому способу, которое составило 51,8%

Заключение: диагностируется эндометриоз.

На 5 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров, положения. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации, фимбрии сохранены. Яичники нормальных размеров, обычной структуры, в правом - желтое тело. На брюшине задних листков широких маточных и крестцово-маточных связок обнаружены множественные поверхностные и глубокие инфильтративные очаги эндометриоза, площадью более 3 см. Произведена деструкция и иссечение очагов эндометриоза монополярным коагулятором. Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины.

Диагноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2

Больная Л. 27 лет. Поступила в клинику с жалобами на бесплодие в браке, болезненные обильные менструации, болезненный половой акт.

Анамнез заболевания: отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции отмечает в течение 2 лет. По этому поводу обращалась в женскую консультацию Ивановского НИИ М и Д. Супружеская пара обследована: по тестам функциональной диагностики цикл двухфазный, гормональный статус без отклонений от нормы, анализ крови на инфекции, передающиеся половым путем (полимеразная цепная реакция) - отрицательный. По УЗИ на 5 день цикла: киста правого яичника, предположительно с эндометриоидным содержимым. По данным гистеросальпингографии - полость матки не изменена, просвет маточных труб имеет неизмененный вид, контрастируются на всем протяжении, контраст свободно поступает в брюшную полость. Мужу 30 лет, обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест положительный.

Менструации с 13 лет, установились в течение года, по 4-5 дней, через 30 дней, регулярные, обильные без падения гемоглобина, болезненные (принимает НПВС). Половая жизнь с 17 лет. Беременностей не было.

Анамнез жизни: в детстве перенесла ветряную оспу, в зрелом возрасте - простудные заболевания, хронический гастродуоденит. Операции, травмы отрицает, аллергических реакций не было. Наследственность не отягощена.

Обследована на онкомаркер СА 125 - в пределах нормы.

Гинекологический статус: наружные половые органы развиты правильно, оволосение по женскому типу, шейка матки конической формы, без дефектов, матка нормальных размеров, отклонена кзади, ограничена в подвижности, безболезненная. Придатки справа увеличены до 5 см в диаметре, туго-эластической консистенции, безболезненные при пальпации, слева - не увелйчены, безболезненны с обеих сторон. Пальпация крестцово-маточных связок болезненна, выделения слизистые.

Клинический диагноз: Бесплодие I неясного генеза. Подозрение на эндометриоз тазовой брюшины. Киста правого яичника (по структуре напоминающая эндометриоидную). Дисменорея. Диспареуния. Аномальное маточное кровотечение по типу гиперменореи без падения гемоглобина.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов по заявляемому способу, которое составило 68,4%

Заключение: диагностируется эндометриоз.

На 5 день менструального цикла произведена лапароскопия, в ходе которой обнаружено: брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров, положения. Маточные трубы не изменены, свободно проходимы при хромогидротубации, фимбрии сохранены. Левый яичник нормальных размеров, обычной структуры, правый увеличен до 5 см за счет эндометриоидной кисты с типичным содержимым, фиксирован к широкой маточной связке. На брюшине задних листков широких маточных и крестцово-маточных связок обнаружены глубокие очаги эндометриоза с гемосидерином, площадью более 3 см. Произведена деструкция и иссечение очагов эндометриоза монополярным коагулятором, цистэктомия справа.

Гистологическое исследование удаленных тканей - эндометриоз брюшины, капсула эндометриоидной кисты.

Диагноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 3

Пациентка К., 26 лет, поступила с жалобами на бесплодие. Анамнез заболевания: отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции отмечает в течение 1,5 лет. Обследована по месту жительства. По тестам функциональной диагностики цикл двухфазный, гормональный статус без особенностей, инфекции, передающиеся половым путем отрицательные. По УЗИ на 10 день цикла свободная жидкость в малом тазу, признаки спаечного процесса в малом тазу. По данным гистеросальпингографии полость матки не изменена, маточные трубы в виде гидросальпинксов, контраст в брюшную полость не поступает. Муж обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест - положительный.

Менструации с 11 лет, установились в течение года, по 5 дней, через 28 дней, регулярные, умеренные, болезненные, мажущие выделения до и после менструации в течение 2-3 дней. Половая жизнь с 16 лет. 1 роды в 2008 году.

Анамнез жизни: в детстве перенесла ветряную оспу, в зрелом возрасте - простудные заболевания, хронический бронхит. В 2014 лапароскопическим методом проведена цистэктомия справа по поводу дермоидной кисты малых размеров. Травмы отрицает, аллергических реакций не было, наследственность не отягощена.

Гинекологический статус: наружные половые органы развиты правильно, оволосение по женскому типу, шейка матки цилиндрической формы, без дефектов. Тело матки чуть больше нормальных размеров, ограничена в подвижности, безболезненная, придатки не увеличены с обеих сторон, безболезненны при пальпации, в боковых сводах определяется болезненная тяжистость.

Клинический диагноз: Бесплодие вторичное, трубный фактор. Хронический сальпингит с образованием двусторонних гидросальпинксов. Подозрение на эндометриоз тазовой брюшины. Дисменорея. Аномальное маточное кровотечение по типу мажущих кровянистых выделение до и после менструации. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (тератома правого яичника). Послеоперационный спаечный процесс органов малого таза.

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов по заявляемому способу, которое составило 51,6%

Заключение: эндометриоз не диагностируется.

На лапароскопии: Брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров, положения. Маточные трубы в виде гидросальпинксов, при хромогидротубации заполняются красителем. Тазовая брюшина без патологических включений. Яичники нормальных размеров, правый в параовариальных спайках, в левом - постовуляторная «стигма». Проведена сальпингостомия по Бруа с обеих сторон.

Эндометриоз не выявлен.

Пример 4

Больная М., 30 лет. Обратилась с жалобами на вторичное бесплодие.

Анамнез заболевания: отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции отмечает в течение 2 лет после второго выкидыша в сроке 8 недель беременности. Обследована по месту жительства. По тестам функциональной диагностики цикл двухфазный, гормональный статус без особенностей, вирус простого герпеса положительный по данным полимеразной цепной реакции (пролечен). По УЗИ на 7 день цикла признаки спаечного процесса придатков. По данным гистеросальпингографии полость матки не изменена, признаки проксимальной окклюзии правой маточной трубы и дистальной окклюзии левой маточной трубы. Муж обследован - спермограмма без отклонений от нормы. Посткоитальный тест - положительный.

Менструации с 13 лет, установились в течение года, по 5-6 дней, через 28 дней, регулярные, умеренные, болезненные, аномальных маточных кровотечений не отмечает. Половая жизнь с 18 лет. 2 мед. аборта (в сроке 7-8 недель с выскабливанием полости матки) и 2 самопроизвольных выкидыша (в сроках 6 и 8 недель беременности) в анамнезе.

Анамнез жизни: в детстве перенесла ветряную оспу, ангину, в зрелом возрасте - простудные заболевания, хронических заболеваний не отмечает. Операции, травмы отрицает, аллергических реакций не было. Наследственность не отягощена.

Гинекологический статус: наружные половые органы развиты правильно, оволосение по женскому типу, шейка матки конической формы, без дефектов, матка нормальных размеров, отклонена кпереди, безболезненная, подвижная, придатки с обеих сторон не увеличены, безболезненные при пальпации. Диагноз: Бесплодие II. Хронический сальпингит с проксимальной окклюзией правой маточной трубы и дистальной окклюзией левой маточной трубы по ГСГ. Спаечный процесс придатков? Дисменорея. Подозрение на эндометриоз тазовой брюшины. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (2 мед. аборта и 2 выкидыша в ранних сроках беременности).

Произведено определение в периферической крови относительного содержания IgD+ клеток в популяции CD19+ лимфоцитов по заявляемому способу, которое составило 34,5%

Заключение: эндометриоз не диагностируется.

На лапароскопии: Брюшная полость свободна. Матка нормальных размеров. Маточные трубы в перитубарных спайках, после сальпингоовариолизиса: маточные трубы умеренно извиты, проходимы при хромогидротубации, фимбрии сохранены. Тазовая брюшина без патологических включений. Яичники нормальных размеров, структуры.

Эндометриоз не выявлен.

Указанным способом обследовано 47 женщин с бесплодием, данные исследований приведены в таблице 1.

Преимущества заявляемого способа

1. Высокая точность - 87,2% и чувствительность - 92,6% способа.

2. Способ позволяет на дооперационном этапе диагностировать наличие эндометриоза у пациенток с бесплодием неясного генеза, и своевременно провести лечебно-диагностическую лапароскопию, что позволит скорректировать тактику ведения пациентки.

3. В случае подтверждения диагноза эндометриоза у женщин с бесплодием неясного генеза заявляемым способом можно избежать проведения диагностической процедуры гистеросальпингографии.