СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДА ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, медицинской генетике и может быть использовано для прогнозирования исхода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) у женщин с бесплодием различного генеза.

Актуальность. Согласно результатам эпидемиологических исследований частота бесплодия в браке колеблется от 8 до 29% (Кулаков В.И. Репродуктивное здоровье населения России // Акушерство и гинекология. - 2002. - №2. - С.4-7). В связи с этим в последнее время все большее распространение получают вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), в частности метод ЭКО и ПЭ. Однако несмотря на широкое распространение и опыт в проведении данной методики частота наступления беременности после ЭКО и ПЭ остается невысокой и по данным разных авторов колеблется от 20% до 40%. При этом проведение даже одного цикла ЭКО сопряжено с существенными экономическими затратами и определенным риском для здоровья женщины, связанным с овариальной стимуляцией (Гришенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Результативность программы ЭКО в зависимости от количества и качества переносимых эмбрионов // Проблемы репродукции. - 2000. - №1. - С.44-47). Разработка прогностических критериев исхода ЭКО позволит существенно повысить его эффективность и избежать излишних материальных затрат за счет более тщательного отбора пациенток на этапе планирования беременности.

Существует способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ (Патент РФ №2193777. Способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ / Сагамонова К.Ю., Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Кузьмин А.В., Ломтева С.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2002. - №33) путем качественной и количественной оценки содержимого фолликулов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости, аспирированной раздельно из правого и левого яичников, исследуют активность пептид-гидролаз и при ее уровне не менее 75 мг/мл/ч в одном из яичников прогнозируют благоприятный исход.

У данного способа имеется ряд недостатков:

1. При осуществлении способа высок риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом, и может осложниться кровотечением.

2. Метод осуществляется на этапе пункции фолликулов, когда невозможно скорректировать тактику ведения пациентки.

3. Необходимость исследования двух образцов фолликулярной жидкости (из правого и левого яичников).

Существует способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (Патент РФ №2357673. Способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / Потехина Ю.П., Щербатюк Т.Г., Хрулева Н.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2009. - №16), включающий проведение трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что фолликулярную жидкость подвергают хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности: при показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50%.

Недостатками способа являются:

1. Высок риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом, и может осложниться кровотечением.

2. Метод осуществляется на этапе пункции фолликулов, когда невозможно скорректировать тактику ведения пациентки.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения у пациенток с аутоиммунными заболеваниями (Патент РФ №2345715. Способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения у пациенток с аутоиммунными заболеваниями / Ярыгина Т.В., Башмакова Н.В., Мазуров А.Д. // Изобретения. Полезные модели. - 2009. - №4), отличающийся тем, что у женщины до начала овариальной стимуляции устанавливают наличие в анамнезе аднексита, определяют наличие в фенотипе HLA-антигенов В18, Cw3, Cw4 и количество тромбоцитов в коагулограмме и вычисляют прогностический индекс F по формуле

F=1,4×X1-1,3×X2-2,4×X3-2,1×X4+0,019×X5-2,5,

где X1 - наличие (либо отсутствие) в фенотипе женщины HLA-антигена В18 (1 либо 0);

Х2 - наличие (либо отсутствие) в фенотипе женщины HLA-антигена Cw3 (1 либо 0);

Х3 - наличие (либо отсутствие) в фенотипе женщины HLA-антигена Cw4 (1 либо 0);

Х4 - наличие (либо отсутствие) в анамнезе аднексита (1 либо 0);

Х5 - количество тромбоцитов в коагулограмме (10⁹/л);

и если F больше 0, прогнозируют удачный исход проведения ЭКО и ПЭ, а при значениях F меньше 0 судят о нецелесообразности проведения ЭКО на данном этапе.

Недостатками способа являются:

1. Метод может быть использован только у пациенток с аутоиммунными заболеваниями.

2. Для анализа HLA-антигенов используется метод серологического гистотипирования, который основывается на реакции лизиса клеток с последующим микроскопированием, точность которого зависит от субъективной оценки исследователя.

3. Метод предполагает определение большого числа вариабельных показателей: HLA-антигенов В18, Cw3, Cw4, количество тромбоцитов в коагулограмме.

4. Сложность математического расчета прогностического индекса.

Технический результат направлен на упрощение (достаточно однократного исследования, результат которого будет действителен при проведении возможных повторных ЭКО) и расширение возможностей прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ у женщин с бесплодием различного генеза, что позволит значительно повысить эффективность программы ВРТ за счет более точного отбора пациенток на этапе планирования беременности.

Технический результат достигается тем, что у женщин с бесплодием до начала овариальной стимуляции в лейкоцитах периферической крови определяют полиморфизм генов HLA II класса и при выявлении носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 или DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют неблагоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (ненаступление беременности), а при отсутствии носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (наступление беременности) с точностью 81,1%.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать исход программы ЭКО и ПЭ у женщин с бесплодием различного генеза путем определения полиморфизма генов HLA II класса в лейкоцитах периферической крови.

Ранее исследование антигенов главного комплекса гистосовместимости использовалось для прогнозирования риска развития ряда заболеваний, в патогенезе которых большое значение имеет аутоиммунный компонент. Имеются данные о значении определенных аллелей, генотипов и гаплотипов по системе HLA в формировании предрасположенности или резистентности к таким заболеваниям, как инсулинозависимый сахарный диабет (Ахмедова Ш.У., Рахимова Д.А. Полиморфизм генов HLA II класса у больных инсулинзависимым сахарным диабетом в узбекской популяции // Иммунология. - 2002. - №5. - С.298-300), анкилозирующий спондилит, ревматоидный артрит, болезнь Рейтера, рассеянный склероз, онкопатология (Коненков В.И. Медицинская и экологическая иммуногенетика. - Новосибирск, 1999. - 250 с.). Широко дискутируется проблема аллоиммунных отношений при беременности с учетом совместимости супругов и, соответственно, матери и плода по антигенам системы HLA (Иммунологическая загадка беременности / под ред. Н.Ю.Сотниковой. - Иванове: МИК, 2005. - 276 с.).

Запуск экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости происходит приблизительно через 96 часов после оплодотворения: клетки развивающегося эмбриона начинают экспрессировать антигены отцовского происхождения. При этом материнская иммунная система не только не отторгает, но и защищает плод (Billington W.D. The nature and possible functions of MHC antigens on the surface of human trophoblast // Reproductive immunology. - New Delhi: Narosa Publishing House, 1999. - P.71-77). Антигены HLA эмбриона, экспрессируемые на поверхности клеток трофобласта, распознаются Т-лимфоцитами матери, и у нее формируется клон иммунных клеток, вырабатывающий специальные "защитные" антиотцовские (блокирующие) аллоантитела (АРСА - antipaternal cytotoxic antibodies, Ab2 - anti-anti HLA antibodies, MLR-Bf - mixed lymphocyte reaction blocking factor), которые покрывают поверхность трофобласта. (Characterization of mixed lymphocyte reaction blocking antibodies (MLR-Bf) in human pregnancy / M.K.Pandey, V.Saxena, S.Agrawal et all. // BMC Pregnancy Childbirth. - 2003. - Vol.19. - P.2.)

На сегодняшний день доказано, что большое число совпадающих антигенов HLA у супругов приводит к недостаточной иммуностимуляции организма матери, в результате чего снижается выработка блокирующих антител и происходит запуск иммунного ответа, направленного против антигенов эмбриона. Это может послужить причиной остановки развития беременности на ранних ее этапах (Beer А.Е., Kwak J.Y.H. Reproductive Medicine Program. Finch University of Health Science. - Chicago. 1999. - 132 p.).

Наличие определенных аллелей, генотипов и гаплотипов по генам главного комплекса гистосовместимости ассоциируется с изменением активности гуморального иммунитета. К примеру, у носителей гаплотипа DRB1*1601-DQB1*0502-DQA1*0102 чаще выражен слабый иммунный ответ на вакцинацию HBs антигеном (The contribution of HLA-Class II antigens in humoral non-response and delayed response to HBsAG vaccination. / B.Vidan-Jeras, V.Brinovec, B.Jurca et all. // Pflugers Arch. - 2000. - Vol.440, Suppl.5. - P.188-189. 11005666 Cit:2, Blood Transfusion Centre of Slovenia, Ljubljana).

Таким образом, можно предположить, что у женщин-носительниц гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501/DQA1*0102-DQB1*0502 вследствие нарушенного иммунного ответа (снижение продукции «блокирующих» аллоантител - АРСА - antipatemal cytotoxic antibodies) нарушается процесс имплантации бластоцисты, что и определяет неблагоприятные исходы процедуры ЭКО и ПЭ.

Заявляемый нами способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.

I. Забор крови для исследования.

Кровь у пациенток получают методом венопункции локтевой вены (объем 3 мл) в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом. В качестве консерванта используют 0,5М раствор ЭДТА в соотношении консервант: кровь - 1:10.

II. Выделение и очищение ДНК.

Выделение ДНК осуществляют из лейкоцитов периферической крови с использованием набора реактивов «Комплект реагентов для выделения ДНК из образцов крови» («ДНК-технология», Россия) по протоколу производителя.

III. Полимеразная цепная реакция и детекция продуктов амплификации.

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводят методом ПНР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Приготовление реакционной смеси, программирование термоциклера и детекция продуктов амплификации осуществляют по протоколу производителя («ДНК-технология», Россия). При выявлении носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 или DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют неблагоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (ненаступление беременности), а при отсутствии носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (наступление беременности).

Отличительные признаки способа. В лейкоцитах периферической крови женщин определяют полиморфизм генов HLA II класса и при выявлении носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 или DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют неблагоприятный исход программы ЭКО и ПЭ, а при отсутствии носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная С., 30 лет, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При анализе генов HLA II класса носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 выявлено не было, дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 7 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения было получено 7 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-и сутки был произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов анализ крови на содержание хорионического гонадотропина показал наступление беременности (341 мМ ед/мл, положительный результат).

Пример 2. Больная Б., 36 лет, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия эндокринного генеза. При анализе генов HLA II класса было выявлено носительство гаплотипа DQA1*0101-DQB1*0501, дан неблагоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 8 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения было получено 7 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-и сутки был произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов анализ крови на содержание хорионического гонадотропина показал, что беременность не наступила (1,2 мМ ед/мл, отрицательный результат).

Пример 3. Больная Ф., 32 года, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу идиопатического бесплодия. При анализе генов HLA II класса было выявлено носительство гаплотипа DQA1*0102-DQB1*0502, дан неблагоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 6 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения было получено 5 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-и сутки был произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов анализ крови на содержание хорионического гонадотропина показал, что беременность не наступила (1,7 мМ ед/мл, отрицательный результат).

Результаты клинической апробации способа представлены в таблице №1.

Чувствительность метода: 76,9%

Специфичность метода: 92,9%

Точность метода: 81,1%

Преимущества заявляемого метода:

1. Способ может быть использован для прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ у женщин с бесплодием различного генеза.

2. Так как метод основан на оценке полиморфизма генов, то достаточно однократного исследования, результат которого будет действителен при проведении возможных повторных ЭКО.

3. Высокая точность - 81,1%, специфичность - 92,9% и чувствительность - 76,9% метода.