Штамм "Калмыкия-16" вируса оспы овец для вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается штамма вируса оспы овец (BOO), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов.

Оспа овец (ОО) - острые контагиозное вирусное заболевание, характеризующиеся лихорадкой папулезно-пустулезными поражениями эпителиальных клеток кожи и слизистых оболочек. Согласно принятой классификации вирус оспы овец относится к семейству Poxviridae род Capripoxvirus.

Вирус является этиологическим агентом высококонтагиозного заболевания, характеризующегося лихорадкой и пузырьково-пустулезной сыпью. Оспа овец регистрируется на всех континентах, за исключением Австралии и Океании (2). В Российской Федерации оспу овец регистрируют эпизодически, в частности 2015 году нотифицировано 9 вспышек (Республике Дагестан, Приморский край, Республика Калмыкия) (8).

Основными путями заражения животных является контактный и воздушно-капельный путь (1). Источник и резервуар инфекции - больные овцы. Передача вируса осуществляется в основном алиментарным путем и через механических переносчиков.

Оспа овец регистрируется во все сезоны года и имеет выраженную тенденцию к увеличению территориального охвата. Заболеваемость при оспе овец колеблется от 20 до 90%, а летальность в зависимости от породы, возраста животных и формы течения болезни может достигать 5-100%. Возбудитель оспы овец состоит в близком генетическом, антигенном и серологическом родстве с возбудителями оспы коз и нодулярного дерматита крупного рогатого скота, но по патогенности они обладают видовой специфичностью (3-7).

Целью данного изобретения является получение нового штамма вируса оспы овец, обладающего стабильными антигенными свойствами для использования в качестве референтного штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигнута путем выделения вируса оспы овец от больной овцы, принадлежащей КФК «Эрдня» Лаганского района Республики Калмыкия во время эпизоотии болезни. Выделенный вирус является новым штаммом возбудителя, выделенным на территории РФ. Полученный вирулентный штамм обозначен как штамм «Калмыкия 16» и депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН под №3160.

Новый штамм «Калмыкия-16» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства. При электронно-микроскопических исследованиях в вируссодержащем материале обнаружены вирусные частицы, размером 300×250×200 нм, морфологически тождественные представителям рода Capripoxvirus семейства Poxviridae.

Культуральные свойства. Штамм «Калмыкия -16» размножается в первичных культурах почки и тестикул ягнят, а также в перевиваемой культуре клеток ПО. Репродукция вируса сопровождается цитопатическим действием, приводящим к образованию характерных «оспенных» поражений на 3-4 сутки культивирования. В культурах гетерологичного происхождения (ПС, МДВК, VERO) без предварительной адаптации вирус не размножается.

Инфекционная активность. Обладает высокой инфекционной активностью, при внутрикожном титровании на овцах титр вируса составляет 10^5,1ИД/см³, в культуре клеток ПО после адаптации накапливается 10^4,5-5,0 ТЦД50/см³.

Антигенные свойства. Вызывает образование вируснейтрализующих антител.

Гемаглютинирующие и гемадсорбирующие свойства. Не обладает.

Патогенность для человека. Не патогенен.

Патогенные свойства. Штамм патогенен для овец всех пород и возрастных групп.

Контагиозность. Штамм контагиозен для овец. Интактные овцы заболевают оспой овец при совместном содержании с инфицированными животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей. Штамм хранят при минус 40°C и «освежают» на овцах. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Молекулярно-генетическая характеристика.

Нуклеотидная последовательность гена GPCR (ген белка, относящегося к суперсемейству семиспиральных хемокиновых рецепторов) на 100% идентична последовательностям штаммов «Srinagar/2000 Р-5», «NISKHI», «Odisha/16», «Srinagar/2000 Р-40» вируса оспы овец.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Изучение биологических свойств штамма BOO «Калмыкия -16» (проверка патогенности для овец).

При внутрикожном заражении в дозе 500 ИД₅₀/0,5 см³ инкубационный период составлял 3-5 дней. У 100% зараженных овец наблюдали угнетение, отсутствие аппетита, потерю веса и характерные оспенные поражения. У 30% зараженных животных наблюдали генерализованную форму течения болезни. Летальность составила 14%. При доброкачественном течении болезни и отсутствии осложнений наблюдали выздоровление, которое наступало на 21-28 сутки.

Пример 2. Штамм «Калмыкия - 2016» используют для получения гипериммунной сыворотки крови для диагностических исследований.

Гипериммунную сыворотку используют в качестве реагента для вирусологических реакций при обнаружении как вирусного антигена в пробах патологического материала от больных оспой овец и павших животных, а также в качестве положительного контроля в серологических реакциях.

Иммунизировали две группы овец: овцам первой группы подкожно вводили вирусвакцину против оспы овец сухую культуральную (штамм НИСХИ, клон Б-5/96) в прививной дозе. Через 14 суток овцам внутрикожно (в несколько точек) вводили по 500 ИД₅₀/0,5 см³ эпизоотический штамм BOO штамма «Калмыкия -16».

Во 2 группу вошли овцы реконвалесценты. На 40 сутки с момента клинических проявлений болезни овцам вводили внутрикожно BOO штамма «Калмыкия -16» в дозе 500 ИД₅₀/0,5 см³.

Динамику накопления антител в крови иммунизированных животных определяли РДП и РН (таблица №1).

Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что на 14 сутки после вакцинации у животных 1 группы титр ВНА составил 1:2. После внутрикожного введения эпизоотического вируса штамм Калмыкия-16 у вакцинированных овец, через 14 суток, активность сывороток в РДП была в разведении 1:2, а титр ВНА увеличился до 1:8.

При иммунизации животных группы №2 (реконвалесценитов) также отмечено значительное увеличение специфической активности сыворотки крови. Титр антител в РДП у переболевших животных достигал значений 1:2, в РН 1:8. После дополнительного внутрикожного введения эпизоотического вируса титры антител в РДП у этих животных оставались примерно на том же уровне, а в РН они возросли и составляли 1:32.

Результаты проведенных исследований показали, что сыворотку крови с высокой активностью можно получать при иммунизации эпизоотическим штаммом ОО «Калмыкия 16» вакцинированных и переболевших овец.

Пример 3. Секвенирование и филогенетический анализ гена GPCR вируса штамма «Калмыкия-16» вируса оспы овец.

Методом нуклеосорбции провели выделение ДНК из культурального материала, содержащего вирус оспы овец, штамм «Калмыкия-16». С использованием 2 пар праймеров GPCR1-GPCR2 и GPCR3-GPCR4 амплифицировали 2 фрагмента гена GPCR (ген белка, относящегося к суперсемейству семиспиральных хемокиновых рецепторов) вируса штамма «Калмыкия-16». Данные фрагменты секвенировали методом Сэнгера с использованием генетического анализатора «АВВ1 PRISM 3130» (Applied Biosystems, США) (Таблица 2). В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента гена GPCR размером 1000 п.о.: 5' -

С помощью программ «Bio Edit 6.0» и «Mega 5.0» провели выравнивание и филогенетический анализ полученной нуклеотидной последовательности с последовательностями гена GPCR штаммов вируса оспы овец, представленных в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Филогенетическое дерево строили по методу Максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп-анализом со 100-кратной повторностью (Рисунок 1).

На дереве видно, что изолят из Калмыкии находится в кластере штаммов вируса оспы овец, выделенных в Индии и Казахстане. Наибольшая степень нуклеотидной идентичности (100%) наблюдается со штаммами «Srinagar/2000 Р-5», «NISKHI», «Odisha/16», «Srinagar/2000 Р-40».

Источники информации

1. Hailat N., An outbreak of sheep pox associated with unusual winter conditions in Jordan./ N.Hailat, O.Al-Rawashdeh, S.Lafi and Z.Al-Rawashdeh // Trop.Anim.Health Prod. 1994. V. 26. P. - 79-80.

2. Garner M.G., The extent and impact of sheep pox and goat pox in the state of Maharashtra, India./ M.G. Garner, S.D. Sawarkar, E.K. Brett, J.R. Edwards, V.B. Kulkarni, V.B. Boyle and S.N.Singh // Trop.Anim.Health Prod.2000. V. 32. P. 205-223.

3. Cam V.M. Control of capripoxvirus infections / V.M. Carn, // Vaccine. - 1993. - V. - 11. - P. 1275-1279.

4. Subba Rao M.V., Antigenic relationships among sheep pox, goat pox and contagious pustular dermatitis viruses.. / M.V. Subba Rao and B.S. Malik, // Acta virol. 1984., 28. P. - 380-387.

5. Kitching R.P., Clinical and antigenic relationship between isolates of sheep and goat pox viruses / R.P. Kitching and W.P.Taylor. // Trop.Anim.Health Prod. 1985. 17. - P. - 64-74.

6. Gershon P.D., Physical characterization of genome of cattle of capripoxvirus / P.D. Gershon and D.N. Black, // Virology. - 1987. - V. - 160. - P. - 473-476.

7. Gershon P.D., A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheep, goats, and cattle/ P.D. Gershon and D.N. Black, // Virology. - 1988. - V. - 164. - P. - 341-349.

8. http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/WI