Штамм "Волгоградский" вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота для вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов.

Согласно принятой классификации вирус нодулярного дерматита крупного рогатого скота относится к роду Capripoxvirus семейства Poxviridae [3].

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (далее - нодулярный дерматит КРС) - это болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеками подкожной клетчатки и внутренних органов, образованием кожных узлов (бугров), поражением глаз и слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов [1, 2].

Нодулярный дерматит КРС относят к особо опасным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить значительный экономический ущерб. В соответствии с новой классификацией он включен в список болезней МЭБ, подлежащих обязательному уведомлению (нотификации), в категорию «Болезни и инфекции крупного рогатого скота» [4, 5, 6].

Целью данного изобретения является получение нового штамма вируса нодулярного дерматита КРС, обладающего стабильными культуральными и антигенными свойствами для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса из патологического материала (струпья) от больных коров из Волгоградской области. Вирус выделили с использованием культур клеток.

Штамм является новым, ранее не известным, выделенным на территории РФ и обозначен как штамм «Волгоградский».

Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3161.

Штамм «Волгоградский» характеризуется следующими признаками и свойствами:

1) морфологические свойства. При электронно-микроскопических исследованиях в вируссодержащем материале обнаружены вирусные частицы размером 300×250×200 нм, морфологически тождественные представителям рода Capripoxvirus семейства Poxviridae.

2) культуральные свойства. Штамм «Волгоградский» размножается в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK). Репродукция вируса сопровождается цитопатическим действием, приводящим к полной деструкции монослоя на 3-4 сут культивирования.

3) инфекционная активность. Обладает среднего уровня инфекционной активностью, накапливается в культуре клеток MDBK в титрах 5,0-5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

4) способ выращивания. Штамм культивируют в монослое перевиваемой культуры клеток MDBK. При оптимальных условиях максимальное накопление достигается через 72-96 ч культивирования. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла-МЭМ с 2% фетальной телячьей сыворотки.

5) Иммуногенные свойства. Вызывает образование вируснейтрализующих антител.

6) Гемаглютинирующие свойства: не обладает.

7) Патогенность для человека: не патогенен.

8) Патогенные свойства. Штамм патогенен для крупного рогатого скота всех пород и возрастных групп. При экспериментальном заражении взрослых коров вызывает повышение температуры тела (41°-41,5) и потерю веса, а также характерные оспенные поражения на коже. При отсутствии осложнений выздоровление наступает на 30-40 сут. У молодняка наблюдается более тяжелое течение.

9) Контагиозность. Штамм контагиозен для крупного рогатого скота. Интактные животные заболевают нодулярным дерматитом при совместном содержании с инфицироваными животными.

10) Трансмиссивность. Штамм передается кровососущими насекомыми (оводы, слепни, мокрецы).

11) Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

12) Способ и срок хранения, периодичность пассажей. Штамм хранят при минус 40°С и «освежают» пассированием в культуре клеток MDBK. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Изучение биологических свойств штамма «Волгоградский»

Примечание: доверительный интервал - 95%.

Как видно из Таблицы 1, штамм «Волгоградский», как нативный, так и лиофилизированный, стабилен при длительном пассировании в культуре клеток MDBK. Множественность заражения 0,05-0,005 ТЦД₅₀/кл. Стабильность штамма обеспечивает возможность использования вирусного материала для конструирования инактивированных вакцин и диагностических препаратов.

Пример 2. Использование вируса нодулярного дерматита КРС, штамм «Волгоградский», для приготовления инактивированной вакцины против нодулярного дерматита КРС.

Для получения производственного вируса отбирали 1-2-дневную культуру клеток MDBK с полным равномерным монослоем, выращенную на культуральных пластиковых одноразовых матрасах с посадочной площадью 225 см³. Из матрасов удаляли ростовую среду и в каждый вносили по 100 мл поддерживающей питательной среды. Затем вносили вирус, множественность заражения при этом составляла 0,05-0,005 ТЦД₅₀/кл. Матрасы с инфицированной культурой помещали в термостат. Выращивание вируса проводили при температуре (37,0±0,5)°С в течение 72-96 ч до проявления характерных цитопатических изменений и поражении 90-100% клеточного монослоя. Затем вирусную суспензию сливали, объединяли и хранили при температуре (-20,0±4,0)°С. Для приготовления инактивированной вакцины использовали вирус с активностью 5,0-5,5 lg ТЦД₅₀/см³. Биологическую активность вируса определяли титрованием на монослойной культуре клеток MDBK. Инактивацию вируса проводили (3-пропиолактоном в разведении 1:4000, поддерживая рН раствора в пределах 7,0-7,4. Вирус инактивировали при комнатной температуре (21±4)°С в течение 2 ч на магнитной мешалке, а затем при 2-6°С в течение ночи (12-14 ч). Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяли путем проведения 3 пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ТК. Для этого в 3 матраса с посадочной площадью 25 см³ с монослоем 1-2-суточной культуры клеток MDBK вносили по 1 см³ вируса в разведении 1:10, выдерживали 20 мин при температуре (37,0±0,5)°С, затем монослой отмывали питательной средой, в матрасы заливали поддерживающую среду и инкубировали в течение 5 сут. Для проведения пассажей испытуемую культуру клеток кратковременно замораживали-оттаивали, содержимое матрасов в разведении 1:10 переносили в 2-дневную культуру клеток MDBK с полным равномерным монослоем и инкубировали еще 5 днй. Полноту инактивации оценивали по отсутствию ЦПД в культуре клеток MDBK на третьем пассаже вируса. К инактивированной суспензии вируса добавляли 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5-10 мг/мл, тщательно перемешивали и оставляли при температуре (2-6)°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч осторожно, не взбалтывая, декантировали 1/3 часть надосадка, доливали инактивированную вирусную суспензию до первоначального объема, тщательно перемешивали и выдерживали еще 24 ч. Приготовленная таким образом вакцина представляла собой суспензию бледно-розового цвета с белым осадком.

Проверку иммуногенных свойств вакцины осуществляли на телятах. До иммунизации и через 21 день после вакцинации от животных отбирали кровь и исследовали сыворотку на наличие вируснейтрализующих (ВН) антител в реакции нейтрализации (РН). РН проводили по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:256) с использованием культуры клеток MDBK. Вакцина вызывала образование ВН-антител у испытуемых животных в титрах 1:8-1:16.

Пример 3. Приготовление культурального специфического антигена вируса нодулярного дерматита КРС штамм «Волгоградский».

Монослойную культуру клеток MDBK, выращенную в матрасах с посадочной площадью 225 см³, заражали вирусом нодулярного дерматита штамм «Волгоградский» с множественностью заражения 0,05 ТЦД₅₀/кл. Вирус культивировали при (37,0±0,5)°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 24-48 ч до появления 30% ЦПД. Культуральную жидкость удаляли и монослой отмывали двукратно ФБР. Клетки снимали с пластика механически. Отделившиеся клетки собирали в небольшом количестве физиологического раствора, осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Затем клетки лизировали добавлением дистиллированной воды в объеме, равном 1/100 исходного объема вируссодержащей жидкости. Полученный материал дважды замораживали-оттаивали и обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин. Суспензию с клеточным дебрисом снова замораживали-оттаивали и удаляли клеточный детрит центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин.

Полученный осветленный лизат инактивировали β-пропиолактоном. С этой целью в 50 мл надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса нодулярного дерматита, вносили 0,04 мл β-пропиолактона и выдерживали 18 ч при (4,0±2,0)°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3 последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток MDBK. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности и обладал активностью в реакции диффузионной преципитации 1:2-1:4.

Источники информации

1. Гуненков В.В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота [Текст] / В.В. Гуненков // Сборник науч. тр. ВГНКИ. - М., 2005. - Т. 66. - С. 46-54.

2. Инфекционная патология животных [Текст]; под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: Академкнига, 2006. - Т. 1. - С. 782-786.

3. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ. Т. 1. Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. - 23 изд. - Paris, 2014. - С. 5.

4. Нодулярный дерматит крупного рогатого скота в Республике Северная Осетия-Алания / В.Н. Герасимов, А.В. Луницин, Н.И. Сальников, А.Е. Гогин, Н.А. Еремеев, Д.В. Колбасов // Ветеринария. - 2016. - №4. - С. 11-14.

5. Clinico-histopathological findings and PCR based diagnosis of lumpy skin disease in the Sultanate of Oman [Текст] / M. Body, K. P. Singh, M. H. Hussain [et al.] // Pakistan Veterinary J. - 2012. - Vol. 32. - P. 1-5.

6. Lumpy skin disease (LSD) in a large dairy herd in Israel, July 2006 [Текст] / J. Brenner, M. Haimovitz, E. Oron [et al.].// Isr. Vet. Med. J. - 2006. - Vol. 61. - P. 73-77.