Способ выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и медицинской генетики и может быть использовано для выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода (ЗРП) у курящих женщин.

Актуальность.

По данным ВОЗ частота ЗРП колеблется в широком интервале от 6,5% в развитых странах Европы до 31,1% в экономически неблагополучных странах Азии [Макаров И.О., Юдина Е.В., Боровкова Е.И. Задержка роста плода. Врачебная тактика: учебн. пособие. - М.: МЕДпресс-информ, 2014. - 56 с.; Савельева Г.М., Курцер М.А., Шалина Р.И. Материнская смертность и пути ее снижения // Акушерство и гинекология. - 2009. - №3. - С. 11-15]. Задержка роста плода является одной из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности, и в последующие годы жизни ребенка ведет к многочисленным изменениям в физическом и психоневрологическом развитии, а также приводит к повышенной соматической и инфекционной заболеваемости [Бикметова Е.С. Задержка роста плода: молекулярно-генетические особенности, факторы риска, прогнозирование: дис… к.м.н. Кемерово, 2014. - 139 с.; Савельева Г.М., Кулаков В.И., Стрижаков А.Н. Акушерство. - М.: Медицина, 2000. - 816 с.; Стрижаков А.Н., Тимохина Т.Ф., Баев О.Р. Фетоплацентарная недостаточность: патогенез, диагностика, лечение // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2003. - Т. 2, №2. - С. 53-63].

ЗРП является полиэтиологичным заболеванием. К факторам риска ЗРП относятся социально-бытовые, соматические, гинекологические, инфекционные, генетические и негативное воздействие факторов внешней среды (табакокурение, алкоголь, прием наркотических средств), о чем свидетельствуют работы ряда авторов [Игнатко И.В. и др., 2006; Савельева Г.М. и др., 1999; Vrijkotte T.G. et al., 2009]. Исследования показывают, что действие одного и того же фактора в одном случае может привести к формированию ЗРП, а в другом случае не вызывает подобных осложнений беременности. Среди многообразия факторов риска и механизмов формирования ЗРП нет какого-либо объединяющего фактора, действие которого позволяло бы определять развитие ЗРП.

Известен способ прогнозирования риска формирования задержки внутриутробного роста плода (ЗВУР) на этапе планирования беременности. При этом учитывают возраст мужа, наличие заболеваний органов дыхания, простудных заболеваний, дисменореи, паритета, а также наличия или отсутствия предгравидарной подготовки. Прогностический индекс риска формирования задержки роста плода рассчитывают по разработанной авторами формуле. При наличии прогностического индекса D более 0 прогнозируют высокую вероятность рождения ребенка со ЗВУР, а при D менее 0 судят о вероятности рождения ребенка с нормальной массой тела (Патент №2476141. Российская Федерация. Способ прогнозирования риска формирования задержки внутриутробного роста плода на этапе планирования беременности / Гончарова С.В., Башмакова Н.В., Мазурова А.Д. // Изобретения. Полезные модели. - 2013. - №6). Однако анамнестические данные являются субъективными, а методика подсчета прогностического индекса трудоемкой.

Существует также генетический способ прогнозирования риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-й степени у беременных. Проводят анализ генов факторов коагуляции FII 20210G/A, FV 1691G/A и FVII 10976G/A. В случае выявления аллеля FVII 10976G и генотипа FVII 10976G/G прогнозируют повышенный риск развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-й степени (Патент №2540928. Российская Федерация. Способ прогнозирования риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-й степени у беременных. / Чурносов М.И., Зарудская О.М., Собянин Ф.И., Полоников А.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2015. - №4). Данный способ позволяет прогнозировать плацентарную недостаточность и синдром задержки роста плода только высокой степени, а определение нескольких полиморфизмов генов приводит к удорожанию способа.

Иммунологический способ прогнозирования задержки роста плода основан на определении относительного содержания CD3⁺CD16⁺56⁺-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплимента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R). Прогностический индекс (PI) рассчитывают с помощью разработанной авторами формулы. При PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния (Патент №2526178. Российская Федерация. Способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода. / Газиева И.А., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Тарасова М.Н. // Изобретения. Полезные модели. - 2014. - №23). Прогнозирование задержки роста плода во второй половине беременности не позволяет проводить комплекс профилактических мероприятий на этапе предгравидарной подготовки.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ диагностики задержки роста плода, заключающийся в том, что из венозной периферической крови выделяют ДНК и путем проведения полимеразной цепной реакции определяют аллель PL-AII гена гликопротеина IIIа, при наличии которого диагностируют задержку внутриутробного развития плода (Патент №2172958. Российская федерация. Способ диагностики задержки роста плода. / Иткес А.В., Радзинский В.Е., Галина Т.В., Хотайт Г.Я., Карпова Е.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2001. - №24). Однако данный способ учитывает только наследственную составляющую патологии без учета средовых факторов, а именно табакокурения. Задержка роста плода является мультифакториальной патологией, то есть развитие ее определяется совместным действием неблагоприятного генетического фона плода и негативным действием факторов внешней среды.

Техническим результатом заявляемого способа является расширение арсенала прогностических средств выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода, а именно у курящих женщин.

Заявляемый технический результат достигается тем, что из периферической венозной крови выделяют ДНК и проводят анализ полиморфизма гена IL-10 G-1082A. При выявлении генотипов IL-10 -1082А/А или IL-10-10S2G/A делают вывод о наличии наследственной предрасположенности к задержке роста плода у курящих женщин.

Проведенный анализ специальной и патентной литературы показал, что предлагаемый нами способ не имеет аналогичных решений по выявлению наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин.

Ранее было широко изучено влияние полиморфизма гена интерлейкина-10 (IL-10 G-1082А) при хроническом вирусном гепатите С. У больных хроническим вирусным гепатитом С достоверно чаще встречались гомозиготные генотипы по аллелю IL-10 -1082А [Емельянова А.Н., Витковский Ю.А. Полиморфизм генов цитокинов ИЛ2 (T330G), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (G1082A) при хроническом вирусном гепатите С // Молекулярная медицина. - 2013. - №3. - С. 41-44]. Проведено изучение полиморфизма генов IL-10 G-1082A у больных с туботимпанальной и тимпаноантральной формами хронического гнойного среднего отита. Доказано, что достоверно чаще встречается среди лиц, страдающих мезотимпанитом, гетерозиготный генотип гена IL-10 -1082G/A. [Байке Е.В., Байке Е.Е. Полиморфизм генов IL-1B, IL-6, IL-10 и TNF-A у больных разными формами хронического гнойного среднего отита. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №4]. Изучено влияние полиморфизма гена интерлейкина-10 на течение коклюша. Коклюш, осложненный пневмонией, достоверно чаще наблюдается у обладателей гомозиготных вариантов генотипа в гене IL-10 (IL-10 -1082А/А), в отличие от здоровых и детей с неосложненным течением коклюша [Епифанцева Е.В. Роль полиморфизма генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082A, С819Т) и ФНОα (G308A) в патогенезе коклюша у детей: автореф. дис… к.м.н. - Чита, 2011. - 18 с.]. Выявлена также связь полиморфного варианта гена IL-10 -1082A/G с риском развития преэклампсии [Радьков О.В. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза, клиники, профилактики и лечения артериальной гипертонии у беременных: дис… д-ра м. н. - М., 2012. - 278 с.]. По данным ряда авторов о связи между наличием полиморфизма гена IL-10 и риском нарушения ранних этапов эмбриогенеза человека противоречивы. Одни авторы считают, что наличие полиморфизмов -592А, -819Т, -1082А промоторного участка гена IL-10 не ассоциировано с повышенным риском невынашивания беременности [Prigoshin N., Tambutti М., Larriba J. Cytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy loss of unknown cause // Am. J. Reprod. Immunol. - 2004. - Vol. 52. - P. 36-41; Kamali-Sarvestani E., Zolghadri J., Gharesi-Fard B. Cytokine gene polymorphisms and susceptibility to recurrent pregnancy loss in Iranian women // J. Reprod. Immunol. - 2005. - Vol. 65. - P. 171-178; Bombell S., McGuire W. Cytokine polymorphisms in women with recurrent pregnancy loss: meta-analysis // Aust NZJ Obstet Gynaecol. - 2008. - Vol. 48. - P. 147-154; Kaur A. Recurrent pregnancy loss: TNF-α and IL-10 polymorphisms // J. Hum. Reprod. Sci. - 2011. - Vol. 4. - P. 91-94]. А в исследованиях Costeas и его коллег [Costeas P., Koumouli A., Giantsiou-Kyriakou A. Th2/Th3 cytokine genotypes are associated with pregnancy loss // Hum. Immunol. - 2004. - Vol. 65. - P. 135-141] выявлена связь между данными тремя полиморфизмами и повышением риска спонтанного прерывания беременности. Ряд исследований показал важность анализа не отдельных полиморфизмов, а гаплотипов. В частности, «GCC» гаплотип (G в позиции -1082, С в позиции -819 и С в позиции -592), индуцирующий высокий уровень транскрипции IL-10, связан с риском преждевременного разрыва околоплодной оболочки и преждевременными родами [Анализ экспрессии гена IL-10 в децидуальной и хорионической тканях при невынашивании беременности / Е.В. Машкина [и др.] //Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №5].

Полиморфные варианты генов цитокинов влияют на их продукцию. Это, в свою очередь, влияет на направленность иммунного ответа, своевременность и эффективность межклеточной сигнализации [Полиморфизм гена ИЛ 10 (С819Т) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта в Забайкальском крае / Н.Э. Доржиева [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. - 2011. - №1. - С. 44-48]. Полиморфизм генов цитокинов является существенным фактором предрасположенности к резистентности или к инфицированию, и в результате к развитию заболевания и длительному его течению с осложнениями. Большую роль в этом играют не только отдельные аллели генов, но и их сочетание [Зима А.П. Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции: автореф. дис.… д-ра. м. н. - Томск, 2008. - 43 с.]. Известно, что IL-10 - это противовоспалительный цитокин, оказывающий тормозящее действие на Т-хелперы 1-го типа, и способен угнетать синтез провоспалительных цитокинов [Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Витковский Ю.А. Единая клеточно-гуморальная система защиты организма // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2005. - №2(22). - С. 3-14].

В последние десятилетия одно из основных мест в патогенезе ЗРП отводят отклонениям в работе иммунной системы, обусловленным изменением уровня и соотношения цитокинов, в том числе противовоспалительного цитокина интерлейкина-10 (IL-10) на разных этапах гестации [Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развития плода / А.В. Кудряшова [и др.]. - Иваново: ОАО "Издательство "Иваново", 2009. - 240 с.; Иммунологическая загадка беременности / Н.Ю. Сотникова [и др.]. - Иваново: Иваново: Изд-во МИК, 2005. - 272 с.]. Основную роль в нарушении продукции и секреции противовоспалительного цитокина IL-10 играют мутации в кодирующих регионах (экзонах) генов цитокина IL-10. Мутация в регуляторном участке гена (промоторе) может влиять на экспрессию гена, т.е. изменять уровень транскрипции гена [Королева О.С., Затейщиков Д.А. Биомаркеры в кардиологии: регистрация внутрисосудистого воспаления // Фарматека. - 2007. - №8. - С. 30-36]. Изучение зависимости содержания белка IL-10 в периферической венозной крови от особенностей экспрессии гена IL-10 показало, что полиморфизм гена IL-10 G-1082А связан с его функциональной активностью, поскольку аллель IL-10 -1082А является низкофункциональным. Присутствие в генотипе человека аллеля IL-10 -1082А определяет пониженную функциональную активность гена цитокина 10 и, как следствие, пониженный уровень белка IL-10 [Interleukin-10 gene promoter polymorphisms and their protein production in peritoneal fluid in patients with endometriosis / X. Zhang [et al.] // Molecular Human Reproduction. - 2007. - Vol. 13(2). - P. 135-140].

Возможно, присутствие в генотипе женщины низкофункционального аллеля IL-10 -1082А и наличие табакокурения как вредного внешнесредового фактора приводит к суммированию негативных эффектов, что на фенотипическом уровне реализуется как задержка роста плода.

Своевременный прогноз развития задержки роста плода у курящих женщин позволит оптимизировать тактику ведения пациентки как на этапе предгравидарной подготовки, так и во время беременности.

Заявляемый нами способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови проводят термо-коагуляционным методом с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» (Литех, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. В пробирку типа «Эппендорф» вносят 1 мл цельной крови и центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 минут со скоростью 3000 об/мин. Собирают верхнюю фракцию клеточного осадка, которую замораживают при -20°С в течение 1 часа. Затем полностью размораживают содержимое пробирки при комнатной температуре и вносят в пробирку реактив «ДНК-экспресс-кровь» в соотношении 1/1. Содержимое пробирки смешивают и инкубируют в течение 15 минут при 99°С. По окончании дают остыть до 70°С и затем центрифугируют со скоростью 12000 об/мин в течение 1 минуты. Полученный таким образом супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК. Далее проводят постановку аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Аллельные варианты гена IL-10 (аллели -1082А) исследуют с использованием наборов реагентов для ПЦР «SNP-экспресс» (Литех, Москва) в режиме реального времени. Анализ основан на одновременном проведении двух реакций амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Данный анализ позволяет выявлять как гетерозиготное, так и гомозиготное состояние полиморфизма. Рабочую смесь готовят из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя; 2,5 мкл реакционной смеси; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Готовят две рабочие смеси: с реакционной смесью «аллель-1» и с реакционной смесью «аллель-2». В отдельные пробирки вносят по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси и в каждую пробирку добавляют по 5 мкл образца ДНК. Капли осаждают кратковременным центрифугированием в течение 3-5 с со скоростью 3000 оборотов в минуту и пробирки перемещают в амплификатор DT-Lite (ДНК-Технология, Россия) с автоматическим программным обеспечением ООО «НПО ДНК-Технология».

Режим амплификации:

93°С - 1 минута

далее 35 циклов

93°С - 10 секунд

64°С - 10 секунд

72°С - 20 секунд - считывание.

Результат считывают по каналу детекции FAM положительным, если значение цикла меньше 27, что соответствует наличию генотипов IL-10 -1082А/А или /L-/0-1O82G/A, и отрицательным, если значение цикла больше 30 - отсутствие генотипов IL-10 -1082А/А и IL-10-1082G/A.

Отличительные признаки способа: проводят анализ полиморфизма гена IL-10 G-1082A и при выявлении генотипов IL-10 -1082А/А или IL-10-1082G/A делают вывод о наличии наследственной предрасположенности к задержке роста плода у курящих женщин.

Сущность заявляемого способа выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин поясняется следующими примерами.

Пример №1. Пациентка М., 27 лет, обратилась в женскую консультацию при ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова" с целью постановки на учет в связи с наступлением беременности.

Первобеременная, первородящая. В анамнезе табакокурение в течение 10 лет до 3-5 сигарет в день; хронический тонзиллит.

Диагноз: Беременность 6 недель. Хронический тонзиллит в стадии ремиссии. Табакокурение.

В женской консультации беременная обследована согласно приказу 572-н МЗ РФ, а также дополнительно проведено обследование на полиморфизм гена IL-10 G-1082A. Выявлен гетерозиготный генотип в гене интерлейкина-10 (IL-10 -1082G/A), что свидетельствует о высоком риске задержки роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. По данным скрининговых УЗИ в сроках 12 и 21 неделя патологии не выявлено. По УЗИ в 32 недели выявлена задержка роста плода (окружность живота плода 253 мм, что соответствует 29 неделям гестации). Женщина госпитализирована в акушерскую клинику ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова", где получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась самостоятельными, срочными родами в сроке 38 недель и рождением живого доношенного ребенка, женского пола, массой тела 2680 г, ростом 48 см. Диагноз ребенка при рождении: Доношенный новорожденный. Задержка роста плода I степени.

Пример №2. Пациентка Е., 34 лет, состоит на учете в женской консультации при ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова", с диагнозом: Беременность 21 неделя. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Рубец на матке после операции кесарево сечение. Хронический гастродуоденит в стадии ремиссии. Табакокурение.

Повторнобеременная, повторнородящая. В анамнезе в 2008 г. медицинский аборт в сроке 4-5 недель без осложнений, в 2010 г. преждевременные роды в 34 недели (беременность осложнилась ЗРП и декомпенсированной плацентарной недостаточностью, в связи с чем проводилось экстренное родоразрешение путем операции кесарево сечение, родилась живая недоношенная девочка 1540 г). В течение 12 лет табакокурение до 10 сигарет в день, хронический гастродуоденит.

В женской консультации беременная обследована согласно приказу 572-н МЗ РФ, а также дополнительно проведено обследование на полиморфизм гена IL-10 G-1082A. Выявлен гомозиготный генотип по низкофункциональному аллелю в гене интерлейкина-10 (IL-10 -1082А/А), что свидетельствует о высоком риске задержки роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. По данным скрининговых УЗИ в сроках 12 и 21 неделя патологии не выявлено. По УЗИ в 32 недели выявлена задержка роста плода (окружность брюшной полости плода 240 мм, что соответствует 28 неделям гестации), допплеровское исследование показало нарушение гемодинамики I "Б" степени. Женщина неоднократно госпитализирована в акушерскую клинику ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова", где получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась срочными родами в сроке 38 недель путем операции кесарево сечение и рождением живого доношенного ребенка, мужского пола, массой тела 2480 г, ростом 46 см. Диагноз ребенка при рождении: Доношенный новорожденный. Задержка роста плода II степени. Церебральная ишемия I степени.

Пример №3. Пациентка Е., 29 лет, обратилась в женскую консультацию при ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова", с диагнозом: Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Рубец на матке после операции кесарево сечение. Перинатальная потеря в анамнезе. Табакокурение.

В анамнезе: в течение 9 лет табакокурение до 12 сигарет в день, в 2007 г. медицинский аборт в сроке 6 недель без осложнений, в 2010 г. преждевременные роды в 36 недель (беременность осложнилась ЗРП, дородовым излитием околоплодных вод и острой гипоксией плода, в связи с чем проводилось экстренное родоразрешение путем операции кесарево сечение, родилась живая недоношенная девочка, 2140 г). На первые сутки жизни выявлена транспозиция магистральных сосудов сердца, умерла на третьи сутки жизни.

В женской консультации обследована согласно приказу 572-н МЗ РФ, а также дополнительно проведено обследование на полиморфизм гена IL-10 G-1082A. Выявлен гомозиготный генотип по низкофункциональному аллелю в гене интерлейкина-10 (IL-10 -1082А/А), что свидетельствует о высоком риске задержки роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. После проведения предгравидарной подготовки наступила беременность. По данным скрининговых УЗИ в сроках 12 и 21 неделя патологии не выявлено. По УЗИ в 31 неделю выявлена задержка роста плода (окружность брюшной полости плода 250 мм, что соответствует 29 неделям гестации), допплеровское исследование: нарушение гемодинамики I "А" степени. Женщина госпитализирована в акушерскую клинику ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова", где получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась срочными родами в сроке 38 недель путем операции кесарево сечение и рождением живого доношенного ребенка, женского пола, массой тела 2680 г, ростом 46 см. Диагноз ребенка при рождении: задержка роста плода I степени. Церебральная ишемия I степени.

Пример №4. Пациентка Е., 25 лет, состоит на учете в женской консультации при ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова" с диагнозом: Беременность 16 недель. Табакокурение. Миопия слабой степени OU.

Повторнобеременная, первородящая. В анамнезе в 2012 г. медицинский аборт в сроке 4-5 недель. В течение 6 лет табакокурение, до 14-15 сигарет в день.

В женской консультации беременная обследована согласно приказу 572-н МЗ РФ, а также дополнительно проведено обследование на полиморфизм гена IL-10 G-1082A. Диагностирован гомозиготный генотип в гене IL-10 по аллелю 1082G (IL-10 -1082G/G), что свидетельствует об отсутствии повышенного риска задержки роста плода. По данным скрининговых УЗИ в сроках 12, 21 и 34 недели патологии не выявлено. Беременность завершилась самостоятельными, срочными родами в сроке 39-40 недель, рождением живого доношенного ребенка мужского пола, массой тела 3480 г, ростом 52 см. Диагноз ребенка при рождении: доношенный новорожденный. Результаты клинической апробации способа приведены в таблице №1.

Точность метода: 85,71%

Чувствительность метода: 91,07%

Специфичность метода: 71,43%

Преимущества заявляемого метода:

1. Способ имеет высокую точность, чувствительность и специфичность.

2. Выявляет наследственную предрасположенность к развитию задержки роста плода у курящих женщин.

3. Позволяет выявить предрасположенность к развитию задержки роста плода у курящих женщин на этапе предгравидарной подготовки.

4. Так как метод основан на оценке полиморфизма генов, исследование проводится однократно.

5. Позволяет своевременно определить комплекс профилактических мероприятий на этапе предгравидарной подготовки и тактику ведения беременной, способствующие оптимизации процессов имплантации плодного яйца и плацентации, профилактики невынашивания беременности и повышения частоты рождения здорового потомства.