Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ ПОЛИОМИЕЛИТА 1, 3 ТИПОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Изобретение относится к новой медицинской биотехнологии и может быть использовано в инфекционных стационарах, как экспресс-метод определения антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови у детей.

Полиомиелит представляет собой острое инфекционное заболевание, которое поражает нервную систему и за считанные часы может привести к общему параличу, остановке дыхания и летальному исходу. Возбудитель полиомиелита (Poliovirus hominis) относится к семейству Picornaviridae, роду Enterovirus и представлен тремя серотипами: I тип - штамм Брунгильд, II тип - штамм Лансинг и III тип - штамм Леон. Наиболее эпидемически значимым считается I тип, который чаще всего способен вызывать развитие параличей. II тип имеет несколько штаммов и также является довольно распространенным. Реже всего обнаруживается III тип. Вирус полиомиелита передается при попадании в желудочно-кишечный тракт веществ, загрязненных инфицированным калом, например воды. Вероятность инфицирования полиомиелитом из таких источников особенно высока у детей младше 5 лет. После инфицирования вирус распространяется из кишечника по всему организму, но наиболее сильно поражается головной и спинной мозг. Вакцинация против полиомиелита включена в перечень обязательных детских прививок. Вакцин от полиомиелита на сегодняшний день две. Обе они вполне эффективны против имеющихся штаммов. Одна из них представляет собой инактивированные вирусные частицы, другая - просто ослабленные. Попав в организм, вирусные частицы вызывают иммунный ответ. В системе приобретенного иммунитета основную роль играют В-лимфоциты, которые продуцируют антитела. Антитела взаимодействуют с поверхностью вируса и могут с ним связываться.

Несмотря на заверения ВОЗ, полиомиелит еще нельзя считать побежденным. И одним из фактов, подтверждающим данное заключение, является то, что многие погибшие от вируса полиомиелита, вызвавшего вспышку в Конго, были привиты от полиомиелита, но вакцинация им не помогла. Вирус стал неуязвимым, и ученые Европы нашли у него необычную мутацию, которая привела к замене аминокислоты в вирусном белке VP1, и поэтому новый вирус не нейтрализовался сывороткой здорового человека, то есть мог вызвать заболевание.

Одним из путей решения актуальнейшей проблемы, поставленной ВОЗ по ликвидации полиомиелита в мире, является разработка вирусологических подходов к экспрессной диагностике определения уровня антител в крови к вирусу полиомиелита 1, 2 и 3 типов у детей, прошедших вакцинацию или в спорных случаях.

Известен способ определения антител к полиомиелиту в крови (Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях - Москва, 1962). В данном источнике предлагают выявлять малоавидные и высокоавидные антитела к полиомиелиту в реакции цветной пробы. Принцип данного теста заключается в том, что в результате жизнедеятельности клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты. В результате цвет входящего в состав среды индикатора (фенолового красного) становится оранжевым. При заражении культуры клеток цитопатогенными вирусами, метаболизм клеток подавляется, рН среды и ее цвет не изменяются (она остается красной). При положительном результате противовирусные антитела блокируют размножение вируса в культуре клеток, и под действием кислых метаболитов последних в среде меняется цвет индикатора. Однако данный метод требует ведения клеточной культуры, что удорожает проведение исследования, отсутствие специального оборудования и специалистов делает невозможным его проведение, а также не является экспрессным методом и не обеспечивает точности определения.

В настоящее время известен способ определения антител к полиомиелиту иммуноферментным анализом (ИФА) (Письмо Федеральой службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека от 17 июня 2013 года N 01/6790-13-32). Тест-система позволяет качественно и количественно определять IgG антитела к вирусу полиомиелита в человеческой сыворотке или плазме. Предлагается давать "качественную" (на основании значений оптической плотности - отрицательный, положительный, пограничный) и количественную (ед/мл - отрицательный, положительный, двоякий) оценку исследования образца сыворотки. Недостатками данного способа являются указания о том, что данная тест-система может быть использована только для научных целей, а полученные результаты не могут быть основанием для терапевтического заключения и должны коррелировать с другими клиническими наблюдениями и диагностическими тестами. Данная тест-система не позволяет определять антитела к каждому из серотипов полиовируса, что не отвечает задачам изучения коллективного (или индивидуального) иммунитета. Эти результаты не могут быть сопоставлены с результатами, получаемыми в других лабораториях, другим, стандартным методом и не могут свидетельствовать о реальной защищенности организма от вируса полиомиелита.

Также существенным недостатком является стоимость набора и его производство за рубежом.

Близким к предлагаемому способу является способ определения антител к полиомиелиту, основанный на реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток ткани (п.3.3 МУ 3.1.2943-11 "Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит В)"). Способ позволяет выявлять присутствие функциональных нейтрализующих антител к серотипам вируса полиомиелита и определять уровень защиты, количественно выраженный в виде титра антител, что отвечает задачам серомониторинга.

Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Этой смесью заражают чувствительную к вирусу культуру клеток. Результат нейтрализации вируса учитывают по отсутствию цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток. Недостатками данного способа является большая трудоемкость; необходимость строгого соблюдения стерильности материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; длительность проведения исследования. Определение антител данным методом сопряжено с ведением клеточных культур, что не обеспечивает экпрессность метода.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ определения антител к вирусам полиомиелита 1, 3 типов в сыворотке крови, технический результат которого заключается в повышении точности и экспрессивности определения антител у детей к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови. Это достигается тем, что в сыворотку крови в модифицированной реакции связывания комплемента вносят убитый антиген вируса полиомиелита, содержащийся в инактивированной полиомиелитной вакцине, и гемолитическую сыворотку, исследуемые образцы выдерживают 3-4 часа при t°+4°C, а затем проводят количественное определение оксидазных ферментов, вышедших из гемолизированных эритроцитов, используя 0.05% тетраметилбензидин, и по степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически по цветовому показателю определяют наличие антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов. Авторами впервые предложен эффективный лабораторный экспресс-способ определения антител у детей к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови у детей. Метод имеет ряд отличий и преимуществ. Обнаружение антител у детей к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови по одной пробе позволяет провести раннюю оценку проводимой вакцинации у детей с определением серотипов полиовируса.

Способ обеспечивает его проведение в любом стационаре, оснащенном лабораторией ИФА, что позволяет судить о проводимой вакцинации, а также получать сведения о проведенной иммунизации у мигрантов и кочующих групп населения. Проведенные исследования могут предотвратить развитие вспышек полиомиелита в РФ. Авторы решили эту задачу, заявляя способ экспрессного определения антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови у детей с помощью модифицированной реакции связывания комплемента с последующим цифровым учетом антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов.

Предложенный способ базируется на оригинальной модификации, заключающейся в том, что за его основу была принята не стандартная реакция связи вируса с антителами, закрепленными на твердой матрице, а высокочувствительная разновидность реакции сорбции комплемента на иммунный комплекс, образующийся в жидкой фазе реакции. Данный комплекс образовывался между убитыми антигенами вируса полиомиелита 1 и 3 типа, содержащимся в инактивированной полиомиелитной вакцине и соответствующими антителами, присутствующими в сыворотке крови у детей. Остаток не сорбированного на комплекс комплемента учитывался при помощи спектрофотометрической аппаратуры. Цифровой учет остаточного комплемента стал возможным благодаря тому, что при лизисе эритроцитов, которые являются основой визуального тестирования результатов РСК, в жидкостную фазу реакции выходит группа оксидазных ферментов, таких как пероксидаза мембран, различные оксидазы и гемоглобин, находящиеся во внутренней структуре эритроцитов. Эти ферменты достаточно легко определяются с помощью оптического тестирования после контакта их с 0.05% тетраметилбензидина. Учет результатов проводится спектрофотометрически.

Авторами установлено, что внесение в лизат эритроцитов раствора стандартного 0.05% препарата тетраметилбензидина резко увеличивает показатель оптической плотности, что создает условия для точного учета минимальных концентраций антител и калибровки проводимой реакции. Точный подбор концентрации эритроцитов в гемолитической системе, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, показал, что для создания оптической плотности в пределах 0,300-0,500 оптических единиц (длина волны 495 нм) необходимо использовать 0,1% взвесь эритроцитов барана.

Таким образом, основной принцип экспрессного теста по обнаружению антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов заключался в следующем.

Авторы обнаружили, что при добавлении к сыворотке антигенов вируса полиомиелита, содержащихся в инактивированной полиомиелитной вакцине и, затем, комплемента, образуется комплекс антиген + антитело + белки системы комплемента. После добавления гемолитической системы лизис эритроцитов барана, а следовательно, выход в раствор оксидазных ферментов, замедлялся и при добавлении 0.05% тетраметилбензидина и перекиси водорода цифровой показатель экстинции был минимален. Если сыворотка крови не содержала антитела к вирусу полиомиелита 1 и 3 типа, то при аналогичном проведении исследования комплекса не образовывалось. После добавления гемолитической системы происходил лизис эритроцитов барана, под действием не связавшихся белков комплемента, сопровождавшийся массивным выходом оксидазных ферментов, и после добавления 0.05% тетраметилбензидина величина экстинции увеличивалась.

Основным преимуществом данного способа является постановка контроля для исследуемых биологических проб. Проводилось исследование без добавления убитых антигенов вируса полиомиелита 1 и 3 типа, содержащихся в инактивированной полиомиелитной вакцине. Если в испытуемом материале присутствовали антитела к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов и в опытной пробе происходило образование комплекса, который и ограничивал выход оксидазных ферментов, то в контрольной группе, из-за отсутствия антител, находящихся в диагностикумах, такой комплекс не образовывался и препятствий для массового выхода оксидазных ферментов не наблюдалось, а соответственно величина экстинции всегда была больше.

При отсутствии в обоих случаях антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов не происходило образование комплексов и величины экстинции практически не отличались друг от друга.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Полученная в лаборатории сыворотка крови разводилась физиологическим раствором в разведении 1:5, затем вносились в 96-луночные полистироловые панели, выпускаемые производством "Биополимер" (Россия) в объеме 0,05 мл. Количество лунок, занимаемых для проведения опыта, соответствовало числу испытуемых сывороток крови. Далее к ним добавлялась разведенная в концентрации 1:100 инактивированная полиомиелитная вакцина в объеме 0,05 мл. В каждую из этих лунок вносилось дополнительно по 4 дозы комплемента, находящихся в объеме 0,05 мл. При такой постановке исследования для каждого материала дополнительно ставились следующие контроли:

- контроль физ. р-ра, внесенный в объеме 0,4 мл;

- контроль комплемента, включающий в себя 0,1 мл физ. р-ра и 0,1 мл комплемента;

- контроль для системы выявления не сорбированного комплемента, куда вносились 0,2 мл физ. р-ра и 0,2 мл гемолитической системы;

- контроль сыворотки крови, который вносился в объеме 0,05 мл с добавлением 0,05 мл физ. р-ра;

- контроли убитых антигенов вируса полиомиелита 1 и 3 типа, содержащихся в инактивированной полиомиелитной, куда вносилось по 0,05 мл физ. р-ра и 0,05 мл данной вакцины.

После контакта данной смеси ингредиентов, проходившей в течение 60 минут при 37°С, для осуществления дальнейшего хода реакции во все лунки, где проходит опыт по определению наличия или отсутствия антител к полиомиелиту 1 и 3 типа и контролям к нему, вносилась система для выявления свободного комплемента. Такая система приготавливалась ex terpore и состояла из оттитрованных эритроцитов барана, так как каждая партия сильно разнилась от предыдущей, и процентное соотношение выбиралось, исходя из 300-500 единиц оптической плотности и гемолитической сыворотки в разведении 1:300. Реакция экпозировалась при +4°С в течение 2 часов для осуществления лизиса и осаждения не гемолизированных эритроцитов. По истечении 2 часов из надосадочной жидкости, образовавшейся после оседания эритроцитов, во всех опытных и контрольных лунках отбиралось по 50 мкл для проведения заключительного этапа - цифровой дифференцировки наличия антител к полиомиелиту 1 и 3 типа. Отобранная жидкость помещалась в отдельные полистироловые панели, куда добавлялось по 50 мкл 0.05% тетраметилбензидина для учета не сорбированного на эритроциты барана комплемента. Через 10 минут реакция останавливалась путем добавления 0,1 мл 1 нормальной H₂SO₄.

Учет реакции проводился сразу после добавления кислоты, так как не исключалась возможность дальнейшего продолжения гемолиза в контрольных и опытных образцах, влекущего за собой изменение цветности реакции, а следовательно, и изменения достоверности полученных результатов. Опыт учитывался на любом иммуноферментном анализаторе. Полученные результаты расшифровывались в сопоставлении всех контролей с исследуемым материалом. Наименьшее цифровое значение, выявляемое в одной из лунок, где находился обследуемый материал и определенная сыворотка, констатировал присутствие у больного антител вирусу полиомиелита соответствующего типа.

Таким образом, в течение одних суток, без использования тканевых культур, оказалось возможным обнаруживать антитела к вирусу полиомиелита в сыворотке крови с определением его серопринадлежности.

В примере 1 приведены результаты обследования сыворотки крови больного С.А., находящегося в клинике института и прошедшего иммунизацию в декретированные сроки (11 лет) направленного на определение антител к вирусу полиомиелита 1 и 3 типа в связи с отъездом в эндемичный район.

Пример 1

Результат обследования

20.02.2017. Анализ №2 Планшет №1

В примере 2 приведены результаты обследования сыворотки крови больного С.А. (3 мес) для определение антител к вирусу полиомиелита 1 и 3 типа.

Результат обследования

20.02.2017. Анализ №3 Планшет №1

Заключение: У обследуемого пациента отсутствуют как материнские, так и собственные антитела к вирусам полиомиелита I и II типа. В декретированные сроки необходимо проведение иммунизации.

Способ имеет большую медико-социальную значимость, отличается простотой и доступностью не требует дорогостоящих тест-систем и оборудования. Основным значением данного способа является возможность точного обнаружения наличия антител вирусов полиомиелита, что позволяет провести раннюю оценку проводимой вакцинации у детей с определением серотипов полиовируса. Способ обеспечивает его проведение в любом стационаре, оснащенном лабораторией ИФА, что позволяет судить о проводимой вакцинации, а также получать сведения о проведенной иммунизации у мигрантов и кочующих групп населения. Проведенные исследования могут предотвратить развитие вспышек полиомиелита в РФ. Предлагаемый авторами способ определения антител к вирусам полиомиелита 1 и 3 типов в сыворотке крови может стать не только общедоступным, но и экспрессным, поскольку его проведение занимает 4-5 часов.