Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВИДНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА G К ВИРУСУ ГЕРПЕСА 6 ТИПА

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для определения фазы инфекционного процесса при диагностике вируса герпеса 6 типа (HHV-6).

Вирус герпеса 6 типа (HHV-6) - это ДНК вирус подсемейства Betaherpesvirinae рода Roseolovirus. Штаммы HHV-6A являются нейровирулентными. HHV-6B чаще выделяются у пациентов с лимфопролиферативными и иммуносупрессивными заболеваниями. Антитела к HHV-6 выявляют у людей от 75 до 90%. При рождении большинство детей серопозитивны за счет материнских антител, титр которых снижается к 5 мес. Однако к одному году соотношение серопозитивных детей к серонегативным такое же, как у старших детей и взрослых. Материнские антитела защищают от инфекции HHV-6 в первые месяцы жизни, но после снижения их титра инфицирование может проявиться различными заболеваниями. Выделяют два подтипа вируса: подтип В вызывает розеолу, лихорадку без сыпи, фебрильные судороги и менингит у детей; подтип А связывают с синдромом хронической усталости, рассеянным склерозом и прогрессированием ВИЧ-инфекции. Инфекция, вызванная вирусом герпеса человека типа 6, является актуальной проблемой современной педиатрии.

Определение фазы инфекционного процесса для диагностики HHV 6-инфекции представляется наиболее актуальным, так как в настоящее время диагностика основана лишь на сравнительном анализе данных вирусологических (выделение вируса на чувствительных культурах клеток, обнаружение вирусных белков), молекулярно-генетических (обнаружение фрагментов генома вируса) и серологических (выявление вирус-специфических антител) исследований.

Известно диагностирование первичной инфекция у иммунокомпетентных лиц на основании корреляции наличия и нарастания титров вирус-специфических антител IgM- и IgG-классов с динамикой развития клинических симптомов. (Герпесвирусная инфекция: эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика, лечение: метод, рекомендации для студентов, врачей-интернов, кл. ординаторов и практ. врачей / ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; Сост.: Н.В. Каражас, Н.А. Малышев, Т.Н. Рыбалкина и др.; Под ред. Н.А. Малышева. - Москва, 2007. - 120 с.) Если вирус-специфические антитела класса М синтезируются через 2 недели после острой первичной инфекции и достаточно быстро сменяются на антитела класса IgG, то первичная ВГЧ-6-инфекция, а также реактивация латентной инфекции могут быть диагностированы по уровню IgG-антител. А в связи с тем, что практически у всех взрослых имеются IgG-антитела к HHV-6 типа, однократное определение антител в крови незначимо, необходимо исследовать как минимум 2 образца в динамике, что вызывает трудности в наборе материала при диагностике.

Изобретение RU №2269134 направлено на разработку способа прогнозирования исходов острого гепатита С путем определения антител к нескольким антигенным участкам двух поверхностных белков (Е1 и Е2) с использованием в качестве антигенов 5 синтетических пептидов. Антитела к поверхностным белкам определяются методом иммуноферментного анализа. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью конъюгата на основе моноклональных антител против IgG человека после добавления субстратного раствора. Однако использование этого метода не дает представления о фазе процесса в разный период развития инфекции и не предназначен для определения степени зрелости выявляемых антител, а следовательно, не применим для определения авидности иммуноглобулинов.

Известен «Способ диагностики острого вирусного гепатита А у детей» (RU №2479847). В данном способе сыворотку больных, разведенную в 100 раз, вносят в два ряда параллельных лунок. Один ряд обрабатывают раствором 6 М мочевины в течение 5 минут, определяют авидность комплекса антиген-антитело класса IgG к вирусу гепатита А. При уровне индекса авидности ≤50% диагностируют острый вирусный гепатит А. Однако данный способ не применим для определения авидности антител к HHV-6 типа, так как в данной модификации не используются специфические белки HHV-6 на поверхности лунок для внесения исследуемого материала.

Изобретение ES №2102966 (А1) - 1997-08-01 направлено на лабораторную диагностику антител IgG с низким уровнем авидности антигенов в случае первичного заражения вирусом краснухи (RUBELLA), цитомигаловирусом, вирусом простого герпеса, вирусом герпеса человека 6, вирусом Эпштейна-Барр и вирусом токсоплазмоза Toxoplasma gondii. Данное изобретение не предполагает использование иммуноферментного определения авидности IgG антител к HHV-6, а выявление вируса HHV-6 иммунофлюоресцентным методом, как указано в источнике, не обеспечивает точности диагностики, по причине использования высококонцентрированного детергента (8М мочевина) и труднодоступного на современном рынке.

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ дифференциальной диагностики вирусного гепатита С» [RU 22626694, 2004]. Способ заключается в том, что после расщепления специфического иммунного комплекса 6-молярной мочевиной в иммуноферментном тесте определяют антитела к неструктурному белку NS4 и по увеличению уровня антител ≥12% дифференцируют репликативную форму вирусного гепатита С, а по уменьшению уровня антител в пределах 50-90% - интегративную форму. Проведение данного метода предполагает обследование образцов сывороток крови больных гепатитом С, вносимых в объеме 100 мкл в лунки иммуноферментного теста с насаженным неструктурным белком р-456. После 40-минутного контакта и отмывки параллельно 6-молярной мочевиной и буферным раствором вносят человеческий антиглобулин, меченный пероксидазой хрена в объеме 100 мкл с последующей инкубацией при 37°С в течение 20 минут. На стадии учета реакции используется ортофенилендиамин в 5% растворе перекиси водорода.

Однако он не применим для определения авидности IgG антител к вирусу герпеса 6 типа ввиду отсутствия необходимых специфических адсорбированных белков вируса HHV-6 на поверхности лунок для внесения исследуемого материала. Использование высококонцентрированной 6-молярной мочевины приводит к дополнительному разрушению поверхностного слоя специфических адсорбированных белков в лунках планшета. Двукратная инкубация в течение 20 и 40 минут при температуре 37°С микропланшета с адсорбированным неструктурным белком NS4 и применение ортофенилендиамина также делает данный способ невозможным для определения фазы инфекционного процесса, вызванного HHV-6. Кроме того, использование данного способа на современном этапе является невыполнимым (приказ №322 МЗ РФ от 21.10.2002 о запрете к применению диагностических препаратов, содержащих в качестве хромогена (субстрата) ортофенилендиамин (ОФД), который является высокоактивным канцерогеном, опасным для здоровья людей и требующим специальной технологии утилизации (приказ МЗ и Соц. развития №706Н от 23.08.10 о специальных условиях хранения сильнодействующих лекарственных препаратах).

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ определения авидности иммуноглобулинов класса G к вирусу герпеса 6 типа. Технический результат данного изобретения заключается в усовершенствовании лабораторной диагностики, а следовательно, повышении точности определения фазы инфекционного процесса при диагностике заболеваний, вызванных вирусом герпеса 6 типа, за счет расщепления слабоавидных антител при обработке детергентом.

Результат достигается тем, что в известном способе путем определения антител в иммуноферментном тесте авторы сыворотку больного вносят в лунки двух стрипов иммобилизованного антигеном вируса герпеса 6 типа планшета, одновременно инкубируют в течение 60 минут, после чего ячейки первого стрипа обрабатывают водным раствором 4 М мочевины, затем оба стрипа промывают и вносят в них конъюгат моноклональных антител к IgG антителам человека, стрипы инкубируют в течение 40 минут, промывают, окрашивают раствором хромогена, выдерживают 20-25 минут при комнатной температуре, реакцию останавливают раствором 0,5 М серной кислоты, после чего определяют оптическую плотность с помощью спектрофотометра и проводят расчет индекса авидности по формуле:

При просмотре научно-технической литературы способов определения авидности IgG антител к вирусу HHV-6 не обнаружено.

В результате проведения многочисленных серологических исследований авторами обнаружено, что увеличение времени инкубации на стадии образования иммунных комплексов антител со специфическими белками вируса HHV-6 до 60 минут и до 40 минут на стадии обработки коньюгатом моноклональных антител к IgG человека, в отличие от прототипа, обеспечивает особые условия для образования прочного комплекса, не подвергающегося трансформации при последующих мероприятиях в ходе проведении исследования.

Авторы впервые использовали 4 М раствор мочевины в качестве детергента, обнаружив, что именно при такой концентрации уже происходит диссоциация связи специфических белков вируса HHV-6 с антителами, находящимися в структуре иммунного комплекса. Использование менее концентрированного раствора не позволяло достигнуть поставленных целей, а повышение концентрации мочевины приводило к полному разрыву комплекса между антителами и белком, находящимся на поверхности полистероловой лунки. В таком случае выявление антител, вышедших из специфического иммунного комплекса и характеризующих его наличие и концентрацию, невозможно, так как отмываются суммарные антитела как из комплекса, так и находящиеся в крови в свободном состоянии. Таким образом, меньшая концентрация мочевины не позволяла добиться поставленных эффектов, большая концентрация - не эффективна, исходя из экономических соображений.

Необходимым условием для проведения данного исследования, в отличие от прототипа, является использование в качестве раствора хромогена - 0,05% тетраметилбензидина вместо ортофенилендиамина, являющегося высокоактивным канцерогеном, опасным для здоровья людей и требующим специальной технологии утилизации. Время выдержки с раствором хромогена в течение 20-25 при комнатной температуре получено экспериментальным путем и является достаточным и необходимым как наиболее оптимальное для получения конечного результата. Авторы обнаружили, что использование в качестве стоп-реагента именно 0,5 М раствора серной кислоты обеспечивает наилучший результат при получении цветового показателя для спектрофотометрического учета. В формуле расчета индекса авидности авторами использовались показатели оптической плотности образцов после обработки исследуемых проб сыворотки 4 М раствором мочевины.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

Для обеспечения проведения исследований по установлению значений авидности IgG антител к HHV-6 используют стандартное оборудование для вирусологических лабораторий и лабораторий, проводящих иммуноферментный анализ (ИФА).

Авидность антител класса IgG к HHV-6 определялась с использованием наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса IgG, основанного на твердофазном непрямом иммуноферментном анализе с использованием очищенного рекомбинантного белка р-100.

Принцип определения авидности антител заключался в обнаружении антител, способных разрушать связь с антигеном (р-100) при обработке образовавшегося комплекса детергентом - 4 М раствором мочевины. При сравнении показателя оптической плотности раствора, подвергшегося воздействию детергента, и с таковым без воздействия детергента рассчитывалось значение снижения экстинции как показателя степени авидности антител.

ИФА проводился по следующей схеме:

1. Связывание антител. Первые лунки двух стрипов оставлялись незаполненными и рассматривались как контроль субстрата, во все остальные вносилось по 90 мкл раствора для разведения сыворотки (РРС) и по 10 мкл исследуемой сыворотки, предварительно разведенной раствором для предварительного разведения (РПРС) с целью получения конечного разведения 1:100. Одни и те же исследуемые сыворотки вносились в следующие за контрольными лунки параллельно в два ряда. Планшет инкубировался при температуре 37°С в течение 60 мин во влажной камере. После инкубации раствор удалялся и один ряд (стрип) промывался 3 раза раствором детергента 4 М раствором мочевины и 2 раза раствором фосфатно-солевым буферным с твином (ФСБ-Т), а второй ряд (стрип) - 5 раз ФСБ-Т.

3. Внесение конъюгата. Во все лунки, кроме лунки для контроля субстрата, добавлялось по 100 мкл рабочего раствора конъюгата - моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена. Планшет инкубировался при температуре 37°С в течение 40 минут. После инкубации раствор из лунок удалялся и промывался 5-ти кратно раствором ФСБ-Т.

4. Проведение реакции взаимодействия с субстратом. Во все лунки вносилось по 100 мкл 0,05% водного раствора ТМБ. Планшет выдерживался в темноте при комнатной температуре в течение 20-25 минут. Спустя указанное время реакция останавливалась внесением 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты.

5. Учет результатов ИФА и расчет индекса авидности (ИА) антител. Измерение оптической плотности (ОП) проводился с помощью спектрофотометра в режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм, не позднее, чем через 10 минут после остановки реакции.

Расчет ИА антител проводился по формуле:

Пример 1

Индекс авидности антител класса IgG к вирусу HHV-6 определялся у 37 детей в возрасте от 1 года до 12 лет, госпитализированных в клинику ФГБУ НИИДИ ФМБА России. В сыворотках крови детей определялись антитела IgG к вирусу HHV-6 класса стандартным методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем, которые выполнялись согласно инструкциям производителя.

Авидность определялась предлагаемым авторами методом.

Дети были разделены на 2 группы:

1 группа - 18 человек, у которых антитела Ig G к HHV-6 были определены дважды с интервалом от 1 года и более и их титр превышал ОП_крит на 25%.

2 группа - 19 человек, у которых антитела Ig G к HHV-6 были определены дважды с интервалом от 1 месяца до 25 дней и их титр превышал ОП_крит на 25%.

Значение для низкоавидных антител устанавливалось на уровне ИА ≤50%, значение ИА ≥60% указывало на наличие высокоавидных антител, а ИА в интервале 50-60% расценивался как пограничный результат.

Получение результатов в обеих группах не менее 85% антител с высоким или низким индексом авидности говорило о правомочности применения данного способа для определения авидности иммуноглобулинов класса G к вирусу герпеса 6 типа.

В таблице 1 приведены контрольные результаты обследования сывороток крови детей 1 группы при применении предложенного авторами метода.

В 88,9% в обследуемой группе были обнаружены специфические IgG высокоавидные антитела, которые определяются только на поздних стадиях герпетической инфекции, что подтверждается и временем, прошедшим от начала заболевания до исследования 2-й сыворотки.

В таблице 2 приведены результаты контрольного обследования сывороток крови детей 2 группы по предложенному авторами методу.

В 89,5% в обследуемой группе были обнаружены специфические IgG антитела с низкой авидностью, которые подтверждают раннюю фазу герпетической инфекции, что соответствует времени от начала заболевания до исследования 2-й сыворотки.

Проведенные контрольные исследования подтверждают правомочность применения предлагаемого способа для определения фазы инфекционного процесса, вызванного HHV-6.

Пример 2

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находилась больная Н.Х., 15 лет с диагнозом рассеянный склероз № и/б 2639. При вирусологическом обследовании биологического материала больной были получены следующие результаты:

Лабораторный диагноз: смешанная вирусная инфекция (реактивация вируса герпеса 1 типа + ранняя фаза инфекционного процесса, вызванного вирусом герпеса 6 типа).

Пример 3

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находился больной Ф.Ю., 5 лет с диагнозом вирусная инфекция неясной этиологии № и/б 3979. При вирусологическом обследовании биологического материала больного были получены следующие результаты:

Лабораторный диагноз: значение ИА=72%, что указывает на наличие высокоавидных антител, которые характеризуют хроническое течение инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа.

Авторами предложен эффективный лабораторный способ определения авидности, вызванной вирусом герпеса 6 типа у детей. Определение индекса авидности вируса герпеса 6 типа дает возможность устанавливать фазу инфекционного процесса, вызванного вирусом HHV-6, длительность заболевания, что оказывается решающим фактором при установлении этиологии заболевания и выборе терапевтической тактики.