Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики периода инфекционного заболевания, вызванного вирусом varicella zoster у детей

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для диагностики периода инфекционного процесса, вызванного вирусом ветряной оспы.

Ветряная оспа - это инфекционное заболевание, вызываемое вирусом varicella zoster, относящимся к семейству герпесвирусов альфа-типа и передающимся воздушно-капельным путем. Заболевание проявляется, в основном, папулезно-везикулярной сыпью на коже, повышением температуры, интоксикацией. Являясь нейротропным, вирус ветряной оспы может также поражать нервную систему и вызывать развитие тяжелых патологий. Значимость ветряной оспы важна в связи с возможным развитием хронической рецидивирующей формы инфекции - опоясывающего лишая, частота которого может достигать 60-70 человек на 100000 переболевших ветряной оспой. Особенно риску развития тяжелых форм и осложненного течения ветряной оспы подвергаются лица с Т-клеточным иммунодефицитным ссостоянием, взрослые, а также дети первого года жизни и дети старшего школьного возраста. Современный эпидемический процесс ветряной оспы характеризуется тенденцией «повзросления» инфекции. Увеличивается вероятность заболевания беременных и, следовательно, риск внутриутробного заражения новорожденных. Иммунологические предпосылки описанных возрастных особенностей клиники ветряной оспы изучены недостаточно. Эти современные наблюдения диктуют необходимость расширения лабораторных методов для углубленной диагностики периода инфекционных заболеваний, вызванных вирусом ветряной оспы, с целью прогнозирования тяжести и исходов заболевания, а также установления периода инфекционного процесса для проведения своевременной адресной терапии.

В настоящее время известен способ диагностики вируса ветряной оспы, основанный на выявлении ДНК VZV в клинических образцах методом ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов-праймеров, комплементарных участкам генов, кодирующих белки VZV (Изобретение RU №2385872 Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека). Данное изобретение позволяет обнаружить непосредственно сам вирус в биологическом материале больного, но не дает представления об ответной иммунной реакции организма и сроках инфицирования, а также возможности прогноза тяжести патологического процесса.

Известен «Метод определения авидности иммуноглобулина G к вирусу varicella-zoster в сыворотке и цереброспинальной жидкости», Kneitz R.-H. и др., 2004. Метод направлен на сравнение авидности IgG антител к вирусу варицелла-зостер вирус (VZV) в парных сыворотках крови и образцах цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Данная методика позволяет параллельно сопоставлять авидность иммуноглобулина G в сыворотке крови и ЦСЖ, служит для диагностики острой инфекции или ее исключения и не зависит от концентрации специфических IgG антител. Метод предложен в качестве диагностического средства для выявления интратекального синтеза антител при вирусном энцефалите, рассеянном склерозе и используется для оценки сопутствующего заболевания ветряной оспой при прогрессировании ВИЧ-инфекции.

Однако данный метод требует обязательного параллельного исследования сыворотки крови и ликвора, что не всегда целесообразно применять в рутинной практике для диагностики заболеваний, вызванных вирусом varicella zoster. Кроме того, к недостаткам этого метода можно отнести необходимость разведения исследуемого материала (сыворотки) в пропорции 1:231, что практически невозможно сделать в рутинной лабораторной практике ввиду необходимости использования дополнительных расходных материалов и выполнения манипуляций, увеличивающих временные затраты на проведение этого исследования, приводящих к удорожанию анализа. Также требуется дополнительное разведение коньюгата, увеличивающее время постановки реакции. Отметим, что при оценке полученных результатов описанного метода используется только одно пограничное значение ИА (<37%), указывающее на острую инфекцию, однако при обследовании детского контингента необходимо учитывать особенности иммунной системы и предполагать различные варианты иммунного ответа организма в соответствии с индивидуальными и возрастными особенностями ребенка.

Наиболее близким способом для диагностики атипичных форм VZV-инфекции, возникшей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая является метод, основанный на анализе спонтанной продукции специфических антител мононуклеарами периферической крови (МПК), возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса (Казанова А.С. и др. Новый метод диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012. - №4. - С. 57-60). Способ основан на анализе спонтанной продукции анти-VZV-IgG в культуре мононуклеаров периферической крови (МПК). Для этого первоначально мононуклеары выделяют из венозной гепаринизированой крови, затем культивировали в стерильных пробирках в питательной среде 48 часов. После определения жизнеспособности клеток проводили ингибирование синтеза белка в опытном образце МПК с помощью инкубации клеток в питательной среде с 30 минут с последующей промывкой и дополнительным тестом на жизнеспособность, а далее вновь культивировали в течение 48 часов одновременно с контрольным образцом, который продолжал изучаться без обработки циклогексимидом. Описанная методика достаточно трудоемка в связи с затратами, связанными с манипуляциями для выделения клеток крови и длительным процессом культивирования (4 суток), что не согласуется с понятием экспрессности диагностического подхода. Кроме того, учитывая постоянные проверки на жизнеспособность выделенных и культивируемых МПК возможны ошибки, связанные с точностью и информативностью получаемых результатов при конечном учете. Данную методику не возможно применять для рутинной диагностики в лабораториях, не предназначенных для ведения клеточных культур, в связи с отсутствием специальных условий и предназначенного для этого оборудования. Также отметим, что метод действительно позволяет диагностировать VZV-инфекцию, однако судить о тяжести процесса представляется затруднительным ввиду получения результатов, показывающих только интенсивность синтеза антител в ПМК, что может зависеть как от индивидуальных особенностей гуморального иммунного ответа, так и от вирусогенеза в организме обследуемого пациента. Таким образом, данный способ не обеспечивает точности и экспрессности диагностики.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ диагностики периода инфекционного заболевания, вызванного вирусом varicella zoster детей, технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности и экспрессности диагностики благодаря выявлению авидности IgG антител с расчетом цифровых показателей, характеризующих периоды заболеваний, вызванных вирусом varicella zoster.

Это достигается тем, что в иммуноферментном тесте исследуемую сыворотку одновременно вносят в лунки двух стрипов, иммобилизованных антигеном вируса varicella zoster, инкубируют в течение 50-55 минут, затем один стрип обрабатывают однократно водным раствором 6М мочевины в течение 15 минут, после чего оба стрипа промывают и вносят в них конъюгат специфических моноклональных антител к IgG антителам человека, инкубируют в течение 30 минут, после промывания окрашивают водным раствором хромогена 10-15 минут при комнатной температуре, реакцию останавливают раствором 0,5М серной кислоты, определяют оптическую плотность с помощью спектрофотометра и проводят расчет индекса авидности по формуле:

и при уровне ИА менее 45% и до 50% диагностируют острый период, при более 50% ИА и менее 65% - раннюю паст-инфекцию, при ИА 65% и более 70% - поздний период заболевания.

Авторами было обнаружено, что увеличение времени инкубации до 50-55 минут, в отличие от 30 минут в стандартном иммуно-ферментном тесте, на стадии образования иммунных комплексов антител со специфическими белками VZV, адсорбированными на поверхности полистероловой лунки, привело к образованию более прочной связи и позволило воздействовать на иммунный комплекс детергентом в большей концентрации. Авторы впервые использовали 6М раствор мочевины в качестве детергента, обнаружив, что именно при данной концентрации и однократной экспозиции 15 минут происходит диссоциация связи антиген-антитело в лунке. Использование менее концентрированного раствора не позволяло полностью расщеплять слабоавидные иммунные комплексы, однако увеличение концентрации детергента приводило к полному разрыву комплексов между антителами и белками, и суммарные антитела удалялись при последующих промывках. Таким образом, меньшая концентрация мочевины не приводила к полному расщеплению низкоавидных связей, использование большей концентрации оказалось неэффекивным. Авторы, впервые используя водный раствор 6 М мочевины и проведя однократную промывку, обнаружили, что значительно уменьшается вероятность отслоения адсорбированных белков с поверхности лунок, а также усиливается действие детергента на иммунные комплексы.

Авторы, существенно сократив продолжительность проведения теста, сократив необходимое время контакта сыворотки с адсорбированными на поверхности антигенами VZV, сокращая стадии обработки детергентом и время экспозиции связавшихся иммунных комплексов с раствором коньюгата в течение 30 минут, неожиданно получили оптимальный результат, повысив экспрессность и точность выполнения анализа.

Время выдержки с раствором хромогена в течение 10-15 при комнатной температуре получено экспериментальным путем и для данной модификации иммуно-ферментного метода является достаточным и наиболее оптимальным для получения конечного результата. В формуле расчета индекса авидности авторами использованы показатели оптической плотности образцов после обработки исследуемых проб сыворотки 6М раствором мочевины. Также предложена интерпретация расчетного значения индекса авидности с оценкой периода инфекционного заболевания, включающего как острый период, паст-инфекцию, так и высокий специфический протективный иммунитет, и активацию хронической персистирующей инфекции при возрастании ИА в динамике через 2 недели.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом

Для обеспечения проведения исследований по установлению авидности IgG антител к VZV может применяться стандартное оборудование для вирусологических лабораторий и лабораторий, проводящих иммуноферментный анализ (ИФА).

Авидность антител класса IgG к VZV определялась с использованием наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса IgG, основанного на твердофазном непрямом иммуноферментном анализе с использованием очищенного рекомбинантного антигена varicella zoster.

Принцип определения авидности антител заключался в обнаружении антител, способных разрушать связь с антигеном VZV при обработке образовавшегося комплекса детергентом - 6М раствором мочевины. При сравнении показателя оптической плотности раствора, подвергшегося воздействию детергента, и с таковым без воздействия детергента рассчитывалось значение снижения экстинции как показателя степени зрелости (авидности) антител.

ИФА проводился по следующей схеме:

1. Связывание антител. Первые лунки двух стрипов оставлялись незаполненными и рассматривались как контроль субстрата, во все остальные вносилось по 90 мкл раствора для разведения сыворотки (РРС) и по 10 мкл исследуемой сыворотки, предварительно разведенной раствором для предварительного разведения (РПРС) с целью получения конечного разведения 1:100. Одни и те же исследуемые сыворотки вносились одновременно в следующие за контрольными лунки параллельно в два ряда. Планшет инкубировался при температуре 37°С в течение 50-55 мин во влажной камере. После инкубации раствор удалялся и один стрип промывался однократно 6 М раствором мочевины с экспозицией 15 минут, затем 3 раза раствором фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), а второй стрип обрабатывался ФСБ-Т, затем также промывался 3 раза, как и опытный стрип.

2. Внесение конъюгата. Во все лунки, кроме лунки для контроля субстрата, добавлялось по 100 мкл рабочего раствора конъюгата - специфических моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена. Планшет инкубировался при температуре 37°С в течение 30 минут. После инкубации раствор из лунок удалялся и промывался 5-кратно раствором ФСБ-Т.

3. Проведение реакции взаимодействия с субстратом. Во все лунки вносилось по 100 мкл 0,05% водного раствора ТМБ. Планшет выдерживался в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Спустя указанное время реакция останавливалась внесением 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты.

4. Учет результатов ИФА и расчет индекса авидности (ИА) антител. Измерение оптической плотности (ОП) проводился с помощью спектрофотометра в режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм, не позднее, чем через 10 минут после остановки реакции.

Расчет ИА антител проводился по формуле:

и при уровне ИА менее 45% и до 50% диагностируют острый период, при более 50% ИА и менее 65% - раннюю паст-инфекцию, при ИА 65% и более 70% - поздний период заболевания, характеризующийся как высоким специфическим протективным иммунитетом, так и возможной активацией хронической персистирующей инфекции при возрастании ИА в динамике через 2 недели.

Способ диагностики периода инфекционного заболевания, вызванного вирусом varicella zoster у детей может быть подтвержден следующими примерами:

Пример 1

Для выявления периода инфицирования определялся индекс авидности антител класса IgG к вирусу VZV у 15 детей в возрасте от 1 года до 14 лет, в момент от 1 до 5 дней после инфицирования вирусом ветряной оспы и проходящих лечение в клинике ФГБУ НИИДИ ФМБА России. В сыворотках крови детей выявлялись антитела IgG к VZV стандартным методом иммуно-ферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем. В Таблице 1 представлено определение периода инфекционного процесса, вызванного VZV у детей.

* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

У 14 детей (86,7%) в сыворотке были обнаружены специфические IgG антитела с низкой авидностью (показатели авидности не превышали показателей 50, которые констатировали раннюю фазу заболевания ветряной оспой. У одного больного (№3 - пятый день заболевания) определялся поздний период инфекции, и пациент (№8 - четвертый день заболевания) была обнаружена ранняя паст-инфекция.

Пример 2

В клинике НИИДИ на отделение нейроинфекций и органической патологии нервной системы был госпитализирован больной Ш.С., 12 лет, с диагнозом ветряночный энцефалит на 10 сутки после высыпаний. Диагноз был подтвержден клинико-ликворологическими данными. При обследовании биологического материала (кровь, ликвор, мазок из ротоглотки) получены следующие результаты, представленные в Таблице 2.

ГЩР ликвора на ДНК VZV - положительно; ПЦР крови на ДНК ЦМВ - отрицательно; ПЦР крови на ДНК ВГЧ 6 - отрицательно; ПЦР мочи на ДНК ЦМВ - отрицательно; ИЦХ исследования мазка ротоглотки на ЦМВ - отрицательно.

* Антитела определялись методом ИФА. Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

Лабораторный диагноз: ветряночный энцефалит, ранняя паст-инфекция.

Пример 3

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находилась больная, Ф.Ю., 5 лет, с диагнозом вирусная инфекция неясной этиологии, подозрение на герпесвирусную инфекцию. При вирусологическом обследовании сыворотки крови больного на группу герпесвирусов методом ИФА были получены следующие результаты, представленные в таблице 3.

* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

Лабораторный диагноз: Герпетическая инфекция, этиологически связанная с ВПГ1, отсутствие заболевания, вызванного вирусом VZV

Таким образом, авторами предложен эффективный и информативный способ диагностики периода инфекционного заболевания, вызванного вирусом varicella zoster у детей, с помощью которого возможно устанавливать острую инфекцию, активацию хронической персистирующей инфекции, а также высокий протективный иммунитет, что оказывается решающим фактором при установлении этиологии заболевания и выборе адекватной терапевтической тактики.